电镜技术在我国核桃属植物研究中的应用

王承建，舒秀阁，梁 静，贾 明，刘丙花，王小芳，于艳萍，赵登超*

(1.山东省航空护林站，山东济南250014;2.山东省林业科学研究院，山东济南250014；3.山东省日照市五莲中学，山东日照262300)

电子显微镜，简称电镜，把人眼睛的分辩能力从0.2mm 拓展至亚原子量级，显著增强了人类观察微观世界的能力，被称之为人类的“科学之眼”。 电子显微镜发明于20 世纪30年代，经过了近百年的发展，电子显微镜先后应用于医学、生物学、化学、物理学和材料学等学科和领域，并与各学科相互交叉，相互渗透，协作发展。 随着电镜技术的不断发展和完善，其与其他科学技术的相互协作也越来越广泛，目前电镜技术在植物学不同树种上的应用也是越来越深入，尤其在植物细胞学、病理学和生理学等的应用越来越广泛。

核桃( Juglans regia L.)为世界四大坚果之一，在亚洲、美洲和欧洲很多地区均有分布。 在我国作为重要的木本粮油树种，从南到北在四川、山东、云南等21 个省（市、区）均有大面积的核桃生产性栽培，因为其适宜栽培范围广，在山地、丘陵或者平原地区均可进行种植，被人们称之为‘铁杆庄稼’。 核桃核仁营养丰富、口感清香，富含生育酚等物质，核桃壳产生显著的经济、生态和社会效益，作为我国重点发展的木本油料树种之一，尤其在我国农村精准扶贫、农业产业种植结构调整和新农村建设等方面发挥了十分重要的作用。 随着核桃产业的快速发展和相关基础理论研究的深入，电镜技术也越来越多地被科研工作者应用在核桃树种的研究中，为此笔者查阅相关文献，综述了电镜技术在我国核桃属植物基础理论研究中的应用和研究成果，同时根据当前核桃产业发展的需求和科学技术研究现状，提出了电镜技术在核桃属植物的应用研究方向和重点，以期为相关人员在核桃方面的科学研究提供参考依据。

1 核桃属植物孢粉学研究

研究表明，核桃花粉形态特征在遗传上具有较强的保守性和稳定性，不同种属的核桃花粉形态特征在研究确定核桃属植物种类起源、进化或分类中具有十分重要的意义。 目前我国科研工作者利用扫描电镜分别研究了核桃不同科属、不同品种或者无性系花粉的形态特征。 毛霞等[1]研究发现胡桃科植物的花粉均为单粒花粉， 根据花粉大小的演化，认为枫杨的演化程度最高，美国山核桃的演化程度最低，而美国黑核桃、普通核桃、华东野核桃、和青钱柳为中等演化水平；根据周孔类花粉最进化，3 孔花粉次之，3 孔沟花粉较原始的原则[2]，认为美国山核桃花粉较核桃、青钱柳和枫杨原始；根据较原始植物花粉均具有光滑且无定型的外壁，花粉表面纹饰的演化趋势为表面光滑→表面具小穴、 小沟状雕纹→粗糙并具疣状纹饰→表面颗粒状→表面网状分类原则[3]，核桃属植物花粉表面纹饰均为密集分布的颗粒状并分布在整个花粉表面，而普通核桃为较为进化的树种。

刘壮壮等[4]和李川[5]等分别对美国薄壳山核桃和浙江山核桃无性系的花粉进行了扫描电镜观察，结果表明美国薄壳山核桃品种‘威斯顿’（Western）、‘卡多’（Caddo）、‘萨波’（Sauber）、‘斯图尔特’（Stuart）、‘马罕’（Mahan）和浙江薄壳山核桃无性系花粉以单粒形式存在， 美国薄壳山核桃花粉具有3个萌发孔，且均匀的分布在赤道面上，赤道面观呈现出椭圆形，极面观因品种不同呈现近圆形或三角形，‘萨波’的花粉体积最大，‘威斯顿’的花粉体积最小；‘威斯顿’、‘萨波’、‘斯图尔特’、‘马罕’ 的花粉表面纹饰较相似，均呈瘤状纹饰，‘卡多’和‘威斯顿’为较进化的品种，‘萨波’则为较原始的品种；浙江山核桃无性系5 号和27 号极面观呈近圆形，而无性系35 号极面观呈近三角形； 三个无性系花粉粒形状均为扁球形，花粉表面呈颗粒状纹饰，均匀分布着颗粒状的突起，表面纹饰差异不明显。 宁万军等[6]利用电镜研究了新疆早实核桃不同品种花粉粒形态特征，发现‘新新2 号’核桃花粉粒性状为扁球形，其余为近球形，花粉大小为中等型；花粉外壁存在多个孔，‘新温905’的孔5 个，较少，‘新新2号’的孔13 个，最多。 对比发现早实核桃萌发孔较山核桃萌发孔小，‘温185’ 核桃品种花粉形态较为匀称，为辐射对称型。

2 核桃花芽分化形态学研究

研究表明果树花芽分化对果实的产量品质均具有十分重要的影响，作为我国重要的经济林树种之一，核桃树体花芽的质量、数量也决定了核桃产量、坚果的品质和质量，进而影响了核桃果农的经济效益。 花芽分化的过程复杂，也是科研工作者关注的重点，目前我国科研工作者已对核桃的花芽分化进程，花芽分化的阶段进行了划分，邓烈和高英等[7-8]利用电镜分别观察了‘阿4 号’、‘辽宁1 号’核桃品种花芽分化进程，人为的把其过程划分为5 个时期，即成花诱导期、花柄分化期、苞片分化期、花被分化期和雌蕊分化期。 核桃花芽分化各个阶段起始和持续时间不同, 主要与核桃栽培区域温度、营养物质和品种不同而表现出显著差异。 核桃雌、雄花发育形成时期不同，根据核桃雌花、雄花发育时间，可分为雌先型、雄先型。 雌先型核桃品种在花芽分化时间上要领先于雄先型品种，雌先型核桃品种在上个生长季完成花被原基的分化，而雄先型核桃品种在生长季当季雌蕊原基中仅完成苞片原基的分化，雌先型品种在进入休眠期之前比雄先型品种至少多分化一轮花器官原基，且与核桃不同品种的开花和展叶的时期无关[9-10]。通过电镜观察确定核桃雄花芽的分化过程和不同类型核桃品种花芽分化时间差异，对于调控核桃花芽质量，调节花芽分化与坐果的关系，保证其果实产量和品质具有十分重要的意义。

3 核桃良种嫁接愈合组织细胞学观察

嫁接繁育良种是核桃优良品种和新品种有效推广的重要技术途径和手段，当前我国核桃良种繁育技术主要以芽接和枝接方法为主[11-12]，利用电镜观测嫁接愈合过程，对于了解和掌握核桃良种壮苗生长发育，促进生产高质量核桃良种壮苗，实现核桃的优质丰产具有十分重要意义。 兖攀等[13]研究了美国山核桃‘马罕’枝接‘波尼’后嫁接体组织愈合的细胞学特征，结果表明，嫁接体嫁接愈合过程经历可划分为4 个时期， 愈合过程时间段为40d 左右，4 个时期分别为砧/穗隔离期、愈伤组织生长期、形成层环构成期和新生维管组织分化期，每个时期的时间间隔分别为5d ～15 d，嫁接后30d 左右为嫁接成活的关键期，愈伤组织的发生期与叶片展开在同一时期，主要产生于形成层处；嫁接未成活的砧穗结合体中愈伤组织较少，并发生褐化现象，不同条件导致愈伤组织生长受阻，可能是影响嫁接成活的重要内在因素。 为此作者认为实际的核桃嫁接（或者高接改优）生产操作过程中，如何为嫁接体愈伤组织的产生、生长和形成层环的构成提供有力的条件保障， 是嫁接技术改进的重要方向和目标，是实现嫁接成活和生产优质良种壮苗的重要途径和保证。

4 核桃枝叶、果皮和种子超微结构观察

利用电镜研究核桃枝条和叶片组织结构，发现核桃枝叶显微结构与核桃的抗逆性（抗旱、抗寒、耐盐碱等）具有显著的相关性，孙志超[14]通过试验筛选出叶片海绵组织厚度、皮孔长度、栅栏组织与海绵组织厚度比和皮层厚度及导管长度5 个指标作为评价山核桃耐旱性能的技术指标。 抗寒性差的核桃品种‘晋龙1 号’细胞叶绿体和质膜损伤明显，且在低温条件下，超氧阴离子的浓度较高，叶片质球较多，叶绿体中基粒片层变薄，叶片的细胞质、线粒体及细胞核中Ca2+浓度始终处于较高水平， 细胞超微结构冷害明显，部分幼叶叶缘呈水浸状；抗寒性强核桃品种‘哈特雷’叶片中超氧阴离子浓度低，叶绿体中脂质球少，细胞内膜系统完整，叶肉细胞质中出现短时间的Ca2+高峰，随后恢复到静息态水平，细胞超微结构变化不大，叶片无明显冷害症状；核桃细胞内膜系统的完整性与超氧阴离子积累之间可能存在一定的相互关系，低温时叶绿体、线粒体可能起着临时贮存Ca2+的作用， 以促进细胞质中Ca2+浓度回落到静息态水平[15-16]。 核桃气孔存在不均匀关闭现象， 盐胁迫下气孔导度存在明显抑制现象，核桃气孔完全关闭是， 保卫细胞中间有一条缝，核桃气孔明显的前后腔现象是气孔的一个基本结构，鉴于核桃气孔结构特征, 测量其气孔开度时要进行正确的定位，同时为正确地区分气孔的边界与保卫细胞内侧壁的外缘提供良好的植物样本[17]。 核桃果实内维管束系统在果实表面有开放的端口，早实核桃与晚实核桃品种存在差异；内果皮（果壳）无维管束联系，核桃果皮分为外、中、内3 层果皮组织结构，外果皮有数层细胞组成，前期表皮细胞密布腺毛，后期发育出角质层和气孔构造；中果皮为果肉大部分，细胞大，中间散生多维管束；内果皮生长前期与中果皮不明显界限，果皮细胞小而透明，生长后期内果皮木质化加速，进一步形成硬壳并转化为石细胞层，其外的维管束组织高度发达成网格状[18]。核桃果实成熟后扫描电镜观察果实核桃表面存在裂纹并有孔洞，实现与外界气体进行交换，造成核桃种子不耐常温贮存。 核桃枝叶抗逆性和果皮发育结构扫描电镜观察结果，为下一步制定适宜的生产栽培管理措施，提高核桃生长势，提高果实产量和品质提供了有效的科学理论依据。

5 核桃木材及核桃壳加工性能

核桃浑身是宝，核桃木、核桃叶、核桃青皮和核桃壳等可加工为多种副产品，核桃木为优质的硬阔木树种之一，被广泛的用于军工、家具制造或者雕刻材料等。 目前，我国科研学者利用扫描电镜技术来研究不同树种木材解剖、木材物理学和力学特征等方面的性质，为树种的遗传改良、木材质地性质提升提供了有力的科学依据[19-20]， 早在20 世纪80年代，我国科研工作者首次利用电镜对中国的裸子植物木材进行了超微结构研究。 80年代末，王代运等[21]利用扫描电镜对核桃楸木材导管分子及周围细胞的关系和各分子大小在量的变化做详细的测定。核桃壳作为重要的复合原料和生物质材料，因其资源再生性而被广泛的应用。 高留意等[22]用钛酸酯偶联剂改性核桃壳粉，与废白土、低密度聚乙烯制备复合材料，同时利用扫描电镜观察核桃壳粉及复合材料表面微观形态，核桃壳粉无纤维细胞，木质素和半纤维含量较多，纤维含量较少，结果发现随着废白土用量的增加，复合材料的力学性能、熔体指数呈先升后降趋势。 常州大学利用电镜和红外光谱分析油浴和微波预处理后的山核桃壳，发现山核桃壳紧密的结构遭到破坏， 变成更加易于酶解的松散、多孔结构[23]。 核桃壳也可作为一种高效吸附材料，李荣华等[27]以核桃壳粉为吸附剂，研究了其对Cr（Ⅵ）的吸附热力学特征，利用扫描电镜观察发现，吸附Cr（Ⅵ）后的核桃壳残渣表面变得光滑，并且棱角变的较为模糊，作者认为核桃壳对Cr（Ⅵ）的吸附不仅仅是一个单纯的物理或者化学吸附过程，核桃壳表面的化学官能团与Cr（Ⅵ）在强酸性的环境条件下发生了氧化还原反应[24]认为核桃壳粉是具有吸附污水中铬的能力和潜在利用价值的生物质吸附剂。 以上研究为核桃壳的综合利用加工提供了有力的技术支持。

6 核桃病虫鉴别观察

电镜技术可有效提高人类的分辨能力，尤其在昆虫微小器官辨别等方面发挥十分重要的作用，我国科研学者利用电镜观察了核桃举肢蛾和透翅蛾的器官形态特征[25-26]，发现核桃举肢蛾雌蛾性腺和雄蛾触角表面进行扫描电镜观察，发现核桃举肢蛾性信息素分泌腺位于腹尖末端8-9 节之间, 为一个由节间膜特化而成的完整上皮环结构, 性信息素感受器有毛形感器和刺形感器，核桃举肢蛾雄蛾触角毛形感器较多可以很好的感知雌蛾的性信息素。 山核桃透翅蛾幼虫头部的形态特征、感器类型、分布特点并对部分感受器的功能进行了初步判断，发现山核桃透翅蛾幼虫的头为下口式， 头部有触角、单眼、上唇、下唇、上颚、下颚、吐丝器等。 触角上有3种感器：其中柄节无感器；梗节具有3 个刺形感器，2 个锥形感器； 鞭节上有1 个栓锥形感器和1 个锥形感器。 口器有7 种感器：其中上唇表面具有12 个刺形感器和1 个叉形感器；上颚茎节具有1 对刺形感器，颚叶和下颚须基部周围有成簇的感觉锥。 颚叶端部有1 个感器，分别为1 个栓锥形感器，1 个锥形感器，1 个锥乳头状感器。为核桃举肢蛾性信息素快速提取、分析、合成提供依据，同时为探讨核桃透翅蛾的各器官功能机制提供理论依据。

7 研究展望

近百年来随着电子显微镜技术的应用发展迅速，电镜技术在核桃属植物的科学研究中也发挥了十分重要的作用，通过‘科学之眼’做到眼见为实，清晰的观察其形态学变化，本文综述了目前电镜技术在我国核桃属植物孢粉学、花芽分化、嫁接愈伤、枝叶抗逆显微结构、核桃壳加工性能和昆虫微小器官辨别方面的应用，为核桃属植物品种鉴别、进化分类、种苗繁育、资源抗逆性评价、副产品加工利用和虫害鉴别等方面的科学研究提供了强有力科技支撑， 有效的加强了我国核桃学科基础理论知识，从而促进了核桃产业发展。 认识到电镜技术在核桃学科发挥重要作用的同时，与电镜技术在其他学科或者树种上的应用研究相比，电镜技术在核桃属植物方面研究还有待于进一步应用，尤其伴随着新技术、新问题的出现，作者认为在核桃芽接体愈伤组织形成、核桃病原菌辨别与分类和高档木材材质分析等方面还有待于进一步深入研究。 与美国、日本等发现国家相比，我国的电镜技术和设备还相对弱后，可引进国外应用的激光焦距扫描显微镜、扫描激光声音显微镜、 直接图像显微镜等仪器设备，进一步开发其功能，提供仪器设备实用效率，合理高效利用现有资源和设备。 随着今后多学科多技术的交叉与协同应用， 尤其是现代计算技术的融合发展，将使电镜技术不断地完善和提升，同时随着电镜样品制备技术提升，将使电镜技术在核桃属植物的科学研究方面发挥更重要的作用，为核桃产业和学科的发展提供更有利的科技支持。