牛奶中6种黄曲霉毒素的检测方法探讨

张 佳 秦 娜 关婷婷 左英芳 柴 磊

(焦作市畜产品质量安全监测中心,河南焦作 454003)

1 理化性质

黄曲霉毒素（AFT）是有香豆素和双呋喃环的化合物，是由寄生曲霉菌和黄曲霉菌产生的次级代谢产物。因其在农产品及食品中广泛存在，并具有毒性和强致癌性而受到重视。目前已被鉴定的有20多种黄曲霉毒素，主要为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1、M2。前四种存在于农产品中，如花生、玉米、麸皮、棉籽、水稻和小麦等。AFTM1、M2是黄曲霉毒素B1、B2被生物体（奶牛）吸收，经肝微粒体单氧化酶系催化，经羟化而衍生成的剧毒代谢产物，污染牛奶影响摄入机体生命安全。黄曲霉毒素破坏细胞膜，抑制 RNA 合成、干扰某些酶的感应方式，主要攻击免疫、造血、肝脏、肾脏、生殖和神经系统，中毒症状为发育迟缓、腹泻、肝损伤、免疫功能下降、癌症等

2 检测方法

因牛奶中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2同时存在，大量文献介绍了黄曲霉毒素B1或M1的检测方法，针对这6种黄曲霉毒素同时检测的方法较少提及，因此探讨同时检测这6种黄曲霉毒素的测定方法意义重大。

2.1 薄层分析法

薄层色谱法前处理程序较复杂、耗时，灵敏度差，实验中接触黄曲霉毒素标准品安全风险高，因实验效率低，肉眼定性定量，准确度不高，目前已较少使用。但作为黄曲霉毒素检测的经典方法，该法不需配备大型仪器，易操作入手。

2.2 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法为快速检测法，不需配昂贵仪器，操作步骤简单，可作为风险监测等大批量样品的初筛。但此法只可测定黄曲霉毒素的总量，且有假阳性、假阴性的的可能。实际应用中常联合高效液相色谱法或超高效液相色谱串联质谱法进一步检测。

2.3 高效液相色谱法

采用免疫亲和柱或多功能净化柱多次萃取和洗脱试样，逐步分离出6种黄曲霉毒素，利用黄曲霉毒素在一定波长下发出蓝紫色荧光，在荧光检测器上定性定量。该方法前处理简单、分离效果好、灵敏度高、定量准确等优点而广为应用。目前前处理净化方法有免疫亲和柱、多功能净化柱，衍生方法有三氟乙酸（TFA）柱前衍生法、光化学柱后衍生法、碘和溴柱后衍生法、大体积流动池直接检测及光化学柱后衍生串联大体积流动池等。试样处理后，净化柱的黄曲霉毒素特异性抗体选择性地与存在的黄曲霉毒素抗原键合，形成抗体-抗原复合体进而洗脱分离出来。AFTB1、AFTG1生直接进样荧光效应较弱，灵敏度低，衍生处理后可增强荧光度。

陈瑞春等冷冻离心分离出牛奶中的脂肪，代替加入氯化钠、蛋白沉淀剂等，减少基质干扰，免疫亲和柱净化，甲醇-乙腈混合溶液（4：5，v：v）洗脱，带荧光检测器的高效液相色谱仪经柱后衍生系统衍生后测定，结果表明该方法法快速、准确、灵敏度高[1]。李红艳等系统比较了柱后光化学衍生化、未衍生化及碘衍生化，试样经稀释后免疫亲和柱净化，液相色谱仪-荧光法测定，柱后光化学衍生化价格较便宜，不需另配制衍生液，在线性范围、灵敏度等方面综合优势突出，易于推广[2]。王军淋等比较了TFA 柱前衍生、光化学柱后衍生、溴和碘柱后衍生及使用大体积流动池直接检测方法，结果表明各方法均能满足要求，然而TFA 柱前衍生法成本较低、多功能净化柱可满足要求，但需接触有毒有害试剂；光化学柱后衍生法样品处理后可直接进样，但需配备光化学衍生器，增加管路的死体积，流动相消耗量大；溴和碘柱后衍生法前处理相对简单，也需配柱后衍生装置，流动相消耗量大；大体积流动池兼具上述方法的优点，目前尚未推广使用[3]。同时发现免疫亲和柱净化效果优于多功能净化柱。

2.4 超高效液相色谱串联质谱法

该法通过对被测试样离子的质荷比（m/z）的测定而进行分析的一种定性定量方法。质谱分析仪器发展迅速，MS检测器具有更高的选择性，可用同位素内标法对分析物确证。GB5009.22—2016第一法介绍了采用同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定食品中黄曲霉毒素B族和 G族的方法，GB5009.24—2016第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定乳中AFTM1和AFTM2的方法。目前尚无出台同时测定牛奶中6种黄曲霉毒素液质方法的标准。王勤等采用C8固相萃取小柱代替价格昂贵的多功能净化柱和免疫亲和柱，在正相萃取机制下，6 种黄曲霉毒素检出限达1.0μg/kg，方法精密度良好，建立了食品中黄曲霉毒素的立固相萃取-液相色谱-串联质谱法，试验样品为油脂类，是否适用牛奶有待考证[4]。