乳腺癌干细胞化学抗性及纳米载体的应用

徐秀丽,马金柱

0 引言

乳腺癌是全世界女性中最常见的非表皮类型癌症，是女性癌症相关死亡的主要原因[1]。目前，乳腺癌的患者通常接受多模式治疗，包括手术、放射治疗和药物治疗等标准方式[2]，前两种方式主要用于根除原发性乳腺肿瘤和局部区域癌组织，药物治疗在乳腺癌术前及术后治疗中发挥重要作用，它可以减轻肿瘤负担，控制或治疗癌症转移[3]。乳腺癌药物治疗可以实现全身治疗，通常包括激素治疗和化疗。激素类药物可抑制癌细胞增殖，化疗主要应用细胞毒性化合物杀死癌细胞，但其有效性受到如下限制:一方面，其在肿瘤组织中的药物浓度较低，而在健康组织中药物含量高，导致疗效下降，毒副作用增加;另一方面，即使药物到达肿瘤，药物或药物组合本身也具有不良反应[4]。

在1994年Lapidot具有里程碑意义的白血病研究之后，Al-Hajj等[5]在乳腺癌中分离并鉴定出乳腺癌干细胞(BCSCs)，是实体肿瘤中分离出的第1批癌症干细胞(Cancer stem cells,CSCs)。癌症干细胞是肿瘤内细胞的一个小亚群，具有自我更新及分化能力,具有高致瘤能力，能够在放、化疗后重新填充肿瘤[6]。常见的乳腺癌化疗药物针对非CSCs，而CSCs仍可以存活，后者是乳腺癌耐药及局部复发和/或远处转移的重要原因[7]。另外，乳腺癌的耐药性可能与CSCs自身的某些特性相关，主要包括ABC转运体的过表达、缺氧及所处的微环境。近年来，研究者提出了越来越多的具有抑制BCSCs作用的治疗剂，例如沙利霉素、氯喹、姜黄素。然而，这些药物大多数溶解性差，有脱靶效应、不稳定性、短循环半衰期、不符合期望的生物分布和低治疗指数的特点，限制了其在体内有效应用。Gao等[8]研究结果表明，纳米载体极大的表面积与体积比提供了高载药量、溶解度增强效应、特异性位点递送机制，可避免药物在正常细胞和组织中沉积，并具有控制释放机制，可为目标部位提供有效的药物剂量，为乳腺癌的有效治疗手段。本文回顾了BCSCs的起源、常见标志物及其所处微环境耐药机制，并总结了3种最常见纳米载体在靶向BCSCs中的最新进展。

1 BCSCs的来源

干细胞由3个主要特性来定义：分化、自我更新和稳态控制[9]，其对于身体的正常运作至关重要，是胚胎发育过程中及人的整个生命过程中组织或器官细胞的来源。肿瘤由异质细胞群组成，在乳腺癌中未分化细胞的少数亚群为BCSCs。关于BCSC的起源多年来一直存在争议，目前关于BCSCs的来源主要有4种观点[10]：①BCSCs是乳腺干细胞在静止状态期间发生的几种有效突变引发致癌转化而形成的。然而，Eun等[11]认为，虽然CSCs与正常干细胞共享几个特征，这并不意味着CSCs起源于恶变的干细胞。②BCSCs是在瞬时扩增祖细胞水平上多个突变累积转化引发的。③BCSCs来源于分化的细胞,分化的乳腺细胞被去分化后重新获得干细胞特性和自我更新特性。④“错位体细胞干细胞”理论认为，CSCs可能源于体细胞干细胞的错位。目前，大多数研究者认为BCSCs来自乳腺干细胞和祖细胞[12]。最近有证据表明，肿瘤微环境的变化有助于MYC驱动的表观遗传重编程导致乳腺上皮细胞去分化为BCSCs样表型[13]。无论提出的理论如何，迄今为止，还没有具体证据证实BCSCs的起源。

2 乳腺癌干细胞标志物

近年来，人们对乳腺癌细胞系中的 BCSCs分子进行了广泛的研究，BCSCs的分子研究将有助于更好地了解乳腺癌的生物学抗性，为发现新的治疗靶点及当前治疗方法的改进和预防疾病复发提供新的方向。目前，最常用的BCSCs标志物有CD44+、CD24-和ALDH1+，这些标志物在三阴性乳腺癌细胞具有更高的百分比[14]，在预测肿瘤反应、转移和存活方面是非常重要的。特异性的生物标志物来表征BCSCs亚群显示出显著的肿瘤异质性，可揭示两种不同的性质：标记CD44+/CD24-表型的BCSCs可将上皮细胞转化为间质细胞 (Epithelial-mesenchymal transition,EMT);另一种是ALDH+表型标志的可将增生性上皮样状态的间质细胞转化为上皮细胞(Mesenchymal-to-epithelial transition,MET)的BCSCs。BCSCs表现出CD4+的强烈表达[15],是Ⅰ类跨膜糖蛋白，由细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质尾部组成，其作为透明质酸的主要受体将细胞微环境信号与生长因子和细胞因子信号集合在一起，并结合其他细胞外基质成分，例如胶原蛋白、层黏连蛋白和纤连蛋白可促进乳腺癌细胞的生长、侵袭和转移性传播[16]。科学家证明CD44+是可靠的癌症干细胞标志物，既可单独使用，也可与其他表面标志物联合使用以识别BCSCs。CD24参与趋化因子受体CXCR4的负调节，是增强乳腺癌细胞黏附、增殖和转移的唾液蛋白。通常CD24在BCSC中表达非常低或不存在，与乳腺癌细胞系中的化学抗性有关，CD24+细胞由辐射处理的CD24-/low细胞通过基因组不稳定性的传递产生[17]。最近另一个公认的标志物是ALDH+，其是一类参与细胞内醛氧化成羧酸和视黄酸的一种解毒酶[18]，主要在细胞质和线粒体中表达，通过酶测定和流式细胞术测量。在乳腺癌中，BCSCs中选择性表达的ALDH1同种型包括ALDH1A1和A3,介导视黄醇向视黄酸的转化，然后视黄酸作为细胞增殖调节剂起作用。据报道，高ALDH1活性也可通过将抗癌药物代谢成无活性代谢物来预防细胞凋亡[19]。虽然CD44+/CD24-/low标志已被广泛用于鉴定具有干细胞性质的乳腺癌细胞，但是关于其致瘤性目前仍存在争议,需寻找新的和更可靠的干细胞标志物。

3 乳腺癌干细胞与耐药性

用于治疗侵袭性乳腺癌的常规疗法最初可能是有效的，但随着时间的推移，乳腺癌耐药性是癌症治疗中持续存在的挑战，是治疗失败的主要原因。临床耐药性的特征在于其不仅对一种药物具有抗性，而且对于广谱药物通常也具有抗性，这种现象被称为多药耐药性(Multidrug resistance,MDR)。BCSCs治疗抵抗机制是多种多样的，但其中最重要的抗性可分为两大类:①由遗传改变引起的内在抗性:即使所述药物从未用于针对特定肿瘤，此类肿癌也存在对一系列药物的抗性[20];②微环境所引起的外在抗性。研究发现，CSCs具有比非CSCs分化的肿瘤细胞高得多的内源性抗性机制，主要原因可能在于CSCs与正常干细胞之间的相似性[21]。由于干细胞维持生物体中的细胞库，因此，保持和保护这些干细胞具有生物学必需性。针对乳腺癌常用治疗药物如顺铂、紫杉醇和多西紫杉醇的主要耐药机制描述如下。

3.1 细胞膜转运蛋白：ABC家族 目前，公认的乳腺癌细胞多药耐药性的一个原因是BCSCs表达高水平的特定ABC转运体，由2个核苷酸结合结构域(Nucleotide binding domain,NBD)和2个跨膜结构域(Transmembrane domain,TMD)组成，底物识别和结合发生在TMD中，其形成孔状结构并通向细胞外空间跨越膜的大部分深度。ABC转运体属于49个膜蛋白家族，通常使用ATP水解的能量以及底物易位将化合物和小分子从胞质溶胶转运到细胞外介质，有助于多药耐药[22]。大多数ABC转运蛋白作为主动转运蛋白起作用，介导跨越血浆和细胞内膜的底物转运，抵抗浓度梯度，ABC转运体的丢失或抑制会影响与各种癌症的分化、侵袭和恶性潜能密切相关的细胞表型[23]。

3.2 缺氧和活性氧 众所周知,乳腺肿瘤在异常生长到一定程度时会引起组织的相对缺氧,造成局部形成缺氧微环境,使得机体诱导产生一系列缺氧效应,其中缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是介导细胞缺氧效应的关键转录因子。在高氧水平下，HIF-1α被泛素化并随后降解，当氧含量降低时，泛素化被抑制并且激活HIF-1α转移到细胞核中，HIF-1α与缺氧诱导因子-1B(Hypoxia-inducible factor-1B,HIF-1B)形成异源二聚体激活缺氧反应元件基因的转录[24]，这些基因促进血管生成以帮助输送氧气，激活增殖和存活途径。缺氧以各种方式引起BCSCs抗性：首先，氧气被称为潜在的放射增敏因子，缺氧会引起更大的放射抗性。其次，缺氧可导致干性相关通路激活和细胞生长条件恶劣，诱导癌细胞静止。激活的HIF-1α可诱导Wnt、Hedgehog通路的表达，减少活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生来促进BCSCs的药物抗性。与正常细胞相比，表达CD44+/ CD24-BCSCs中ROS清除基因、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶上调、较低的ROS水平可导致BCSCs群体对放、化疗诱导的应激的高度抵抗[25]。另外，BCSCs标志物ALDH1通过直接去除氧自由基和间接产生抗氧化剂化合物诱导BCSCs的放射抗性[26]。ALDH1阳性肿瘤对紫杉醇和表柔比星耐药，并且其耐药性在化疗后增加。

3.3 微环境和治疗抵抗 CSCs的微环境被称为“生态位”，BCSCs存在于由多种类型基质细胞组成的壁龛中。肿瘤微环境有助于BCSCs的生长和增殖，促进转移和耐药[27]。有报道，有几种类型的细胞在肿瘤微环境中起作用，包括癌症相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs)、肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)、间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)和细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)，每种细胞都具有诱导肿瘤治疗抗性的独特方式[28]。

3.3.1 CAFs 刺激肿瘤细胞生长、增殖和转移转化的成纤维细胞被称为CAFs[29]。CAFs是肿瘤微环境中最丰富的细胞类型，可以通过表达α平滑肌肌动蛋白、成纤维细胞活化蛋白、肌腱蛋白-C与正常成纤维细胞相区别。研究表明，CAFs通过分泌蛋白质、外泌体和ECM重塑因子诱导癌症进展以及对癌症治疗的抵抗[30]。CAFs 分泌的卷曲相关蛋白2分泌减少以及Wnt10B、Wnt16B分泌增加导致Wnt信号通路的过激活,增加了p-糖蛋白和ATP结合盒G2的表达，这些蛋白质充当化学抗性的驱动力[31]。CAFs分泌的主要成分是转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β)，后者在降低乳腺癌干细胞的增殖率方面具有至关重要的作用，可促进癌细胞休眠，使BCSCs在化疗期间保持静止状态[32]。另外，来自浸润性乳腺肿瘤的细胞系将TGF-β1高水平分泌到培养基中，TGF-β是最重要的EMT诱导剂，可在这些细胞中诱导EMT[33]。此外，来自CAFs的生长因子FGF以自分泌和旁分泌的方式与受体结合，并激活增殖信号通路PI3K-AKT和促分裂原活化蛋白激酶，它们通过交叉激活，共享下游信号传导途径，增加了DNA依赖性蛋白激酶的表达，抑制促凋亡Bcl-X1和凋亡诱导因子的表达，从而减少对放、化疗的反应[34]。

3.3.2 TAMs CD34+骨髓祖细胞作为单核细胞在血流中流动，渗入组织后分化成组织特异性巨噬细胞，在肿瘤微环境中被认为是TAMs。TAMs通过广泛的生长因子、细胞因子和趋化因子共同与癌细胞相互作用,诱导治疗抵抗。活化的巨噬细胞通常分为M1或M2。在肿瘤微环境中，TAMs主要分化为M2巨噬细胞，M2巨噬细胞具有致瘤功能，并且比M1巨噬细胞具有更低的细胞毒性。有报道，M2巨噬细胞通过分泌TGF-β和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)激活EMT信号传导途径和肿瘤微环境ECM重塑，诱导肿瘤细胞的EMT导致治疗抵抗[35]。TAMs分泌的蛋白质如基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)可以引起血管生成，诱导治疗抵抗[36]。

3.3.3 ECM ECM是主要由成纤维细胞分泌的分子的集合。为了形成肿瘤，癌细胞必须形成ECM的附着物。细胞外基质中的黏附分子与整合素在乳腺癌的耐药机制中发挥重要作用:一方面，通过细胞黏附分子和整合素将癌细胞黏附到纤维连接蛋白或层黏连蛋白等细胞外基质成分中，诱导乳腺肿瘤细胞对阿霉素的耐药性[37];另一方面，细胞表面黏附分子感知ECM的方式也影响核结构和染色质组织，这种染色质重组可以影响对结合或破坏DNA药物的耐药性[38]。在乳腺癌中，ECM也可形成物理屏障，将治疗剂与癌细胞分开，从而保护CSCs免受化学治疗剂的影响。此外，ECM含有几种与CSCs中膜蛋白相互作用并激活干细胞和增殖信号通路以及耐药性的蛋白，例如，ECM中丰富的透明质酸是BCSCs表面CD44+受体的配体，在交互时，其调节CSCs属性的获取和维护[39]。此外，肌腱蛋白C增强Wnt和Notch信号通路的效率，稳定乳腺癌。

3.3.4 MSCs MSCs作为骨髓来源细胞的亚群在结缔组织中普遍存在，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和成纤维细胞，并在伤口修复和免疫反应中具有多种作用[40]。MSCs位于基质中时，分泌多种细胞因子和趋化因子，如CXCL12、CXCL7和IL-6/IL-8，激活NF-κB途径，诱导BCSCs表型，这些分泌物也促进乳腺癌的治疗抵抗。此外，MSCs和乳腺癌之间的物理相互作用激活非酪氨酸激酶受体Src及其下游PI3K/Akt通路，并增强对曲妥珠单抗的耐药性。总体而言，MSCs在癌症进展中发挥重要作用，并使癌细胞对治疗方法具有抗性[41]。

4 纳米医学在乳腺癌干细胞药物递送中的应用

BCSCs具有独特的生长恢复能力，包括自我更新能力，分化潜能，以及对包括放、化疗在内的大多数抗癌药物的耐药性，有助于其发展和整体侵袭性[42]。目前关于BCSCs靶向且表征良好的生物标志物较少，因此，近年来，研究者提出许多靶向BCSCs制剂。由于这些药物水溶性差、循环时间短、不稳定和脱靶效应，使其在临床中应用失败[43]。BCSCs靶向药物递送系统通过改善生物利用度，可特异性地将抗BCSCs药物携带至BCSCs而不发生脱靶效应。目前，研究者较为关注的纳米载体有聚合物纳米颗粒(Polymer nanoparticles,PNPs)、脂质体、胶束[44]。其通常由3个部分组成：核心材料、治疗药物和表面改性剂。

4.1 聚合物纳米颗粒 PNPs是广泛用于药物递送的最公认的纳米颗粒之一，是最简单的纳米医学形式的软材料[45]。抗癌剂在PNPs表面内或表面上被吸附、包封或缀合，其能够在持续一段时间内向肿瘤部位提供所需剂量的抗癌剂。例如，制备硼替佐米(Bortezomib,BTZ)负载的聚(乙二醇)-b-(乳酸)纳米颗粒[(poly ethylene glycol)-b-(poly lactic acid),PEG-b-PLA]可增强BTZ的水溶性和稳定性，有效地将BTZ递送到BCSCs和非CSCs中，导致增殖抑制和细胞凋亡的启动。与游离BTZ相比，通过纳米颗粒的递送增加了黏附细胞和球囊细胞中的BTZ摄取，延长BTZ的循环半衰期和增强肿瘤组织内的药物积累。随后，该研究小组在相同的PEG-b-PLA纳米颗粒中包封多柔比星(Doxorubicin,DOX)和全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA),与游离药物相比，包封的ATRA和DOX均具有较慢的体外释放曲线，与单药递送相比，共体递送系统在体外和体内均可抑制肿瘤生长[46]。此类双重载药纳米颗粒系统的优点包括延长循环半衰期、改善药代动力学和增加肿瘤摄取[47-48]。Chittasupho 等[49]将 CXCR4 的拮抗剂 LFC131装载入聚丙交酯乙交酯(Polylactide glycolide,PLGA)纳米颗粒中，并包埋强力霉素(DOX)，得到纳米药物LFC131-DOX-NPs，结果显示，其可显著抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导凋亡，并抑制SDF-1Α对乳腺癌细胞的促转移作用。

4.2 脂质体 脂质体是由两亲性磷脂双层组成的胶体纳米载体，其可以加载亲水性和疏水性药物。脂质体具有生物相容性、易于表面修饰和血液循环时间长的特点，是抗BCSCs治疗的理想纳米载体。Onivyde@是2015年FDA批准的伊立替康纳米脂质体制剂，不是乳腺癌常用药物，然而，在包含乳腺癌的晚期难治性实体瘤的Ⅰ期研究中，Onivyde®的疾病控制率为45.5%[50]。用吉西他滨(Gemcitabine，GEM)包封的透明质酸缀合的脂质体攻击BCSCs，透明质酸结合的脂质体通过靶向BCSCs上表达的CD44+，显著增强GEM的细胞毒性、抗迁移和抗集落形成能力,同时，可增强GEM在血液中的稳定性，并显著降低GEM对正常健康细胞的全身毒性[51]。

4.3 胶束 聚合物胶束衍生于自组装两亲性嵌段共聚物,这些胶体颗粒含有亲水和疏水组分，为各种修饰提供平台，以提高靶向效率。聚合物胶束由于其均匀性、小尺寸和延长的循环时间，成为用于抗癌治疗的流行药物载体[52]。在一项研究中，研究者们将PTX负载的和抗CD44+抗体功能化的PLGA-co-PEG聚合物胶束用于治疗乳腺癌细胞系，结果显示，将PTX包封到靶向的PLGA-co-PEG胶束中，增加了BCSCs对PTX的敏感性[53]。

5 结语

尽管在过去20年中乳腺癌治疗取得了巨大进步，但乳腺癌仍然是女性最常见的恶性肿瘤。目前，大多数抗癌剂不能区分癌细胞和正常细胞，导致严重的全身毒性。此外，化疗期间获得性耐药性进一步降低了治疗效果。随着癌症干细胞理论的提出，BCSCs与实体肿瘤的分离以及对细胞、分子和信号通路的广泛了解，强化了治疗失败和治疗抵抗是由于癌症干细胞的存在，这是一个具有高增殖性的亚群。BCSCs治疗抵抗的因素包括ATP结合核转运体过表达、ALDH1活性增加、ROS清除和肿瘤微环境。靶向BCSCs需要解决几个关键问题，首先，BCSC标志物也被身体的正常细胞共享，难以控制与靶向BCSCs相关的不良反应；其次，目前BCSCs导致耐药的机制尚未明确，难以开发靶向药物。纳米载体有明确的前景，通过适当的递送载体，可以减少化疗中的不良反应，克服BCSCs获得的多药抗性，并进一步提高疗效。纳米药物载体具有调节持续药物释放、选择性靶向肿瘤细胞、绕过药物外排、改善药物治疗指数和逆转肿瘤细胞中耐药性的潜力。与游离药物相比，纳米材料包裹的药物可以通过不同的机制进入靶细胞，以避免药物转运蛋白，并增加药物的细胞内积累和逆转耐药性。纳米载体与靶向技术相结合以克服或逆转耐药性是近年来重要且有前途的研究领域，需要进一步对纳米医学治疗领域进行广泛研究，以确保体内应用的安全性。