脉冲LED黄光对皮肤细胞黑素生成的影响

戴 惟，韩秋漪，李福生，张善端

(复旦大学电光源研究所，上海 200433)

1 皮肤光疗简介

光疗法是用于治疗各类疾病的最古老的疗法之一，在古埃及、古印度和中国，阳光在治疗皮肤病方面的应用已有数千年历史。20世纪60年代末，匈牙利医生恩德·梅斯特(Endre Mester)使用低功率红宝石激光(694 nm)照射小鼠来研究激光的致癌性。令他感到意外的是，激光并未导致癌症的产生，但改善了小鼠受照面被剃去的小鼠毛发的生长。这是近代首次低水平光疗法(low level light therapy，LLLT)的案例，为皮肤光学开启了一条新的研究路径。发展至今，用于皮肤光疗的光源主要包括相干光(如激光)和非相干光(如LED)两类，并在全世界范围内得到普及。目前，国内外对于激光皮肤光疗的研究体系较为成熟，临床应用更为广泛。

1.1 皮肤光疗的作用机制

人体皮肤由表皮层、真皮层和皮下组织构成。表皮层含有角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞和麦克尔细胞。角质形成细胞占表皮细胞的80%以上，参与表皮分化、角化等作用；黑素细胞占表皮细胞的10%左右，起到遮挡和反射紫外线的作用；朗格汉斯细胞占表皮细胞的3%～5%，为免疫活性细胞；麦克尔细胞则具有非神经末梢介导的感觉作用。真皮层主要由纤维和基质构成，常驻细胞包括成纤维细胞和肥大细胞。成纤维细胞在伤口愈合和皮肤再生中起到重要作用。其他细胞如巨噬细胞、真皮树状细胞等也或多或少地存在于真皮层[1]。

细胞光生物效应的机制涉及分子、细胞和组织水平的作用，其机制尚未完全明确。当前研究普遍认为，光主要作用于皮肤细胞中的发色团，发色团吸收光子能量并转化为热能和化学能，激活线粒体呼吸链组分，从而导致一系列细胞反应。发色团是指赋予化合物颜色的分子(或分子的一部分)，通常以共轭π电子体系和金属络合物形式存在。人体中的发色团主要包括血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、黄素、黄素蛋白和卟啉等。皮肤组织中常见的目标发色团是含有铁和铜的细胞色素C氧化酶(CCO)，位于线粒体呼吸链中[2-4]。德国生物化学家奥托沃伯格发现细胞色素氧化酶负责细胞呼吸的关键步骤，并控制了该过程最终的化学反应。

除一氧化碳(CO)外，一氧化氮(NO)也通常会取代氧与细胞色素氧化酶结合，进而阻碍细胞呼吸[5]。当细胞呼吸被阻断时，会产生自由基或活性氧(ROS)形式的化学信号，过量时会导致细胞凋亡[6]。研究表明，光照会促进NO从细胞色素C氧化酶(CCO)中解离，使得氧再次与其结合并增强呼吸链活性[7]、增强酶活性[8]、影响电子传递[9]并促进线粒体呼吸和三磷酸腺苷(ATP)的生成[10-13]。此外，通过对活性氧物质(如单态氧物质)的调节，光照将进一步改变细胞的氧化还原状态，诱导细胞内多种信号传导途径的激活，改变与细胞增殖、存活、组织修复和再生相关的转录因子水平。

相对于高功率激光而言，虽然LLLT在近年来应用快速普及，但在某些方面仍存在不确定性。一是入射在细胞上的光子信号转换成被照组织中生物效应的分子机制尚未完全明确；二是在临床应用中，光照剂量和参数的选择存在着大量的不确定性，包括波长、辐照度或功率密度、脉冲结构、相干性、极化、照射时间、接触与非接触应用等。已有研究表明，细胞对于光剂量的反应有双相效应，即过小的辐照度或时间对于细胞没有影响，过大的辐照度或时间可能具有抑制作用。因此可能存在辐照度和时间的最佳平衡值，且不同的波长、组织类型、氧化还原状态下的绝对数值会有所不同，并受到不同脉冲参数的影响[14]。

1.2 黑素合成的机制

黑色素是由酪氨酸或3,4-二羟基苯丙氨酸的一系列化学反应形成的一类生物色素。人体皮肤颜色主要受色素沉着过程的影响，包括黑素的合成、转运和代谢等环节，具体包括：在黑素小体中进行的黑素细胞的合成与黑素储存，黑素小体从细胞核周边向树突末端的转移以及向邻近角质形成细胞的传递，角质形成细胞的再分布和降解等[15]。

黑素生成是一种多步酶促生化反应，通过酪氨酸的一系列化学反应实现。酪氨酸经由酪氨酸酶(TYR)催化后转变成多巴(DOPA)，多巴被氧化脱氢后生成多巴醌。在半胱氨酸的参与下，一部分多巴醌合成褐黑素；另一部分多巴醌形成多巴色素，最终重排为5，6-二羟基吲哚，吲哚与结构蛋白结合成黑素蛋白即常说的黑素。该一系列过程中TYR和TRP-1是所涉及的关键酶。酪氨酸酶(TYR)是黑色素合成中的关键酶，能够催化黑色素合成的早期限速步骤，即底物(能和酶特异性结合的物质)酪氨酸羟化和DOPA氧化过程。黑色素合成的速率与酪氨酸酶的量和活性直接相关。酪氨酸酶相关蛋白1 (TRP-1)也具有与TYR相似的催化活性，主要作用是将酪氨酸运送给黑素小体，因此黑色素合成速率也与TRP-1的合成正相关[16，17]。

黑素细胞前体起源于神经嵴，并迁移分化到各个部位，包括表皮、毛囊、内耳、脉络膜、软脑膜等。小眼畸形相关转录因子(MITF)参与这种迁移过程，是分化过程最早的标记物之一，可以通过调控TYR基因家族来影响黑素合成过程。研究表明，将MITF cDNA转染至成纤维细胞中促进了成纤维细胞转化为树突细胞的过程以及黑素细胞特异性标志物(如酪氨酸酶TYR和酪氨酸相关蛋白TRP-1)的表达。TYR和TRP-1的编码基因，即第一个发现的MITF靶基因，由MITF直接调节[18]。

1.3 光照模式

光照模式可分为脉冲光和连续光。这两类模式对于细胞的具体影响机制目前仍无定论，但脉冲光通常被作为皮肤光疗中一类常见的手段用于临床治疗[19，20]。

Sterenborg等[20]使用各类血卟啉文献中的数据进行理论计算，认为当峰值辐照度低于4×108W/cm2时，脉冲宽度为10 ns、100 ns、1 μs、10 μs、100 μs，脉冲模式与连续模式光动力疗法的效率相同。Farouk等[21]在14只大鼠背部制造椭圆形创面，分别使用100～500 Hz不同频率脉冲和连续光(635 nm，1.0 J/cm2，0.89 mW/cm2，3次/周)照射进行伤口愈合情况对比，结果显示100 Hz相对于其他频率脉冲光有更好的愈合效果，但与连续光相比并无改善。文章认为连续光在该实验中有更好的治疗效果，原因在于连续光带来的光子刺激增加。Brian等[22]通过组织模拟剂量计研究脉冲/连续模式下光动力剂的吸收情况，使用690 nm、300 mW/cm2的连续光和脉冲光(10 Hz，10 nm脉宽)照射剂量计，结果显示脉冲光在剂量计中的穿透性比连续光更强。文章认为高峰值辐射照射会引起激发态饱和，降低剂量计吸收系数，使得脉冲光穿透深度更深。Brodon等[23]将人体HEP-2细胞在完全DMEM培养基中培养，以670 nm、5 J/cm2的连续光和不同频率脉冲光(6 Hz、18 Hz、36 Hz、100 Hz、600 Hz)照射72 h，并与无光照组对比，评估细胞增殖和氧化爆发情况。结果显示细胞增殖在100 Hz脉冲条件下得到最大刺激，而氧化爆发在600 Hz时得到最大刺激，从而推断脉冲模式能够减少黑色素对光子的吸收，使得更多光子到达靶细胞产生治疗效果。文章认为其原因可能在于特定频率脉冲光能够穿过黑色素之间的“空穴”而更好地到达靶细胞。Barolet等[19]对10名患者前臂进行高低辐照度下连续和脉冲光照(660 nm，高辐照度：60 mW/cm2，低辐照度：5 mW/cm2)，治疗完成72 h后在每个测试区域中收集疱液并使用放射免疫测定法测定胶原蛋白合成速率。结果显示：高辐照度下，脉冲模式III型前胶原生产速率增加50%，连续模式增加29%；低辐照度下，脉冲模式III型前胶原生产速率增加76%，连续模式增加38%。文章认为其原因可能在于脉冲模式能提供细胞周期性松弛时间，避免成纤维细胞衰竭，维持细胞活性。此后Barolet等[19]进一步细化脉冲参数，使用630 nm、8 J/cm2光照研究了在单层培养的成纤维细胞模型中使用各种脉冲或连续光传输模式对I型前胶原蛋白刺激的影响，结果显示脉冲模式优于连续模式，最佳脉冲参数为：脉冲持续时间(pulse duration) 100 μs，脉冲串间隔(pulse train interval) 750 μs，每串脉冲数(pulses per train) 4个，脉冲间隔(pulse interval) 1000 μs。但最佳组合参数仍有待评估。

2 黄光LED装置

2.1 LED光源制备

本文设计并制作了一款参数可调的590 nm黄光LED装置以进行实验。该装置可以改变驱动电源的占空比、频率和功率，也即辐照度和辐照时间可调，具备6个可调频率(10 Hz、50 Hz、100 Hz、250 Hz、500 Hz、1 000 Hz)和4个可调占空比(25%、50%、75%、100%)，并采用无极调光来调节辐照度。当占空比改变时，该装置的峰值辐照度将相应改变，以保持恒定的平均辐照度，由此确保在相同照射时间内，脉冲模式和连续模式的总剂量(J/cm2)相等。光源模块采用小功率LED封装器件，以11并17串的排布方式进行表面贴装，如图1所示，PCB尺寸为200 mm×80 mm。单颗封装器件额定功率为0.3 W，整个模块的标准输入电压为36 V。考虑到用于光色电热参数测试的积分球直径较小，用30个相同规格的LED封装器件串联制作了一个小型LED光源模块来测试光电参数，如图2所示，PCB直径为80 mm。测试模块的PCB板材料与实验用LED器件相同，以确保散热性能一致。

图1 细胞实验用LED光源模块Fig.1 LED light source module for cell experiment

图2 参数测量用LED光源模块Fig.2 LED light source module for parameter measurement

2.2 LED光源的特征参数

常用温度测量工具(如热像仪和热电偶)无法直接获得LED芯片的PN结温度(结温)，因此我们采用正向电压法间接测量结温。其原理是在给定的小电流下，LED芯片或封装器件的正向电压和结温之间存在近似线性关系。测量过程包括定标和测量两个步骤。

第一步定标。将测试用LED光源模块放入恒温箱中，经过约2 h的充分热交换后可认为结温与恒温箱温度相同，对LED施加1 mA恒定小电流，利用结温测试仪(上海力兹，LEDT-300B)测得此电流下串联封装器件的正向电压；测定不同恒温箱温度下的正向电压，可以获得正向电压与结温的关系，由系统自动拟合成定标曲线，该曲线在一定温度范围内接近线性。

第二步测量。LED在设定好的大电流条件下工作，结温测试仪会周期性地切断工作电流，对LED光源模块施加1 mA小电流，时间持续20 ms，测定瞬时正向电压，根据定标曲线可计算得出该工作电流下的结温。

在测量结温的同时，采用积分球和光谱仪测量LED模块的光色参数，并测定电参数。参数测试用LED光源模块贴装在水套表面，使用恒温循环水浴来模拟环境温度。水浴温度依次设定为45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃和85 ℃。LED模块的输入电流设定为0.03 A、0.075 A、0.15 A、0.3 A、0.45 A和0.6 A，分别对应于额定电流的0.2、0.5、1、2、3、4倍。结温与电流的关系如图3所示，可见随着输入电流的增大，结温几乎线性增加。但即使输入电流增加到额定值的3倍，结温仍保持在140 ℃以下。因此，如散热良好，封装器件可实际工作在3倍额定功率而不损伤。

图3 结温与电流的关系Fig.3 The dependence of junction temperature on forward current

图4为辐射功率与输入电流的关系，可见在额定电流的3倍范围内，辐射功率随输入电流增加而增加。功率达到3倍以上时，辐射功率开始下降。随着芯片内热量的不断积累，结温逐渐升高，将导致载流子逸流增加，从而降低器件的注入效率和发光效率。在实际使用中，输入功率选择应小于额定值的三倍，并考虑辐射效率参数。

图4 辐射功率与输入电流的关系Fig.4 The dependence of radiant power on forward current

辐射效率是辐射功率与输入功率之比。图5所示为辐射效率随电流的变化。当输入电流为额定值的0.5倍时，辐射效率最高，此后辐射效率几乎呈线性下降。根据一般的设计要求，辐射效率必须达到10%以上。再考虑到工作温度一般不高于45 ℃，合适的工作功率应在额定功率的2倍以内。

图5 辐射效率与输入电流的关系Fig.5 The dependence ofradiant efficiency on forward current

当结温变化时，LED芯片的峰值波长也会有所变化。当输入电流增加至2倍额定值时，PN结温度上升约25～30 ℃，如图3所示；峰值波长红移约2 nm，如图6所示。但相对而言，与荧光粉型LED相比，芯片型LED的波长一般偏移更小。

图6 主波长与输入电流的关系Fig.6 The dependence of dominant wavelength on forward current

2.3 恒定辐照度控制

通常当照明模式由连续转换为脉冲模式时，LED器件的平均辐照度将发生变化。例如，当脉冲占空比从100% (连续光)变为50%时，由于峰值辐照度保持不变，但导通时间减半，这将导致每个周期的平均辐照度减半。本实验过程中，保证了相同照射时间内的总“剂量”相同，亦即平均辐照度相同。

本实验设计的LED装置能够根据占空比自动改变峰值辐照度，例如当占空比减半时峰值辐照度加倍，以确保平均辐照度不变。为了验证该控制功能，用分光光度计PLA-20 (远方光电，杭州)测定连续和脉冲(50%占空比，10 Hz)照射模式下的照度(lx)和辐照度(W/m2)。每种模式分别进行三次测量取均值，如表1所示，连续光模式下的平均辐照度为171.8 W/m2，脉冲光模式的平均辐照度为169.5 W/m2。两种模式的平均测量结果无明显差异，在合理误差范围内(<1%)，平均辐照度取6次测量的均值170.7 W/m2。

表1 连续和脉冲光的平均辐照度测量

*P>0.05, 无显著差异。

3 生物实验

将人表皮黑素细胞(HEM)分别用20 J/cm2连续光(10 Hz，100%占空比)和20 J/cm2脉冲光(10 Hz，50%占空比)在距离2 cm处照射20 min，并与无光照(0 J/cm2)组进行对比。为了避免来自光源的热干扰，我们在照射前后测试了距离光源2 cm处的温度，结果显示温度没有变化。

3.1 细胞活性测量

实验评估了不同光照条件下的细胞活力。将HEM (每孔2×103个)一式三份接种到100 μl生长培养基中的96孔板中，分成3组并分别用不同光照条件。在照射24 h后，采用Cell Count Kit-8来处理样本(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)，然后用Multiskan GO酶标仪(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)测量波长450 nm处的每个孔的吸光度，从而测定细胞活力。

3.2 黑素含量测量

将原代培养的HEM (每孔5×105个)一式三份接种到100 μl生长培养基中的96孔板中，分成3组并分别采用不同光照条件。照射后24 h，将HEM在70 ℃条件下于1 N NaOH中溶解1 h，然后用Multiskan GO酶标仪(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)通过波长475 nm处的吸光度测量相对黑色素含量。

3.3 酪氨酸酶活性测量实验

将原代培养的HEM (每孔5×105个)一式三份接种到100 μl生长培养基中的96孔板中，分成3组并用不同光照。照射后24 h，用PBS洗涤HEM，然后在4 ℃条件下在RIPA缓冲液中孵育30 min后进行裂解。然后将100 ml裂解缓冲液接种到96孔板中。用Multiskan GO酶标仪(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)测量波长630 nm处的吸光度。

3.4 实时荧光定量PCR

该实验旨在评估在不同光递送下黑色素合成中3种显着酶(即MITF，TRP-1和TYR)的mRNA表达。PCR扩增使用MITF，TRP-1和TYR引物分别在以下条件进行：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s40个循环，60 ℃ 34 s，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min和95 ℃ 15 s。使用设备为DNA Thermal Cycler 9600 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。

3.5 Western Blot免疫蛋白印迹

该实验旨在评估在不同光照下黑色素合成中3种显着酶的蛋白质表达。裂解HEM并通过RIPA缓冲液从HEM中提取蛋白质。通过10% SDS-PAGE (EpiZyme, Shanghai, China)分离提取蛋白质，然后电转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore, Billerica, MA, USA)上。在室温下在5%脱脂奶粉中孵育1小时以阻断非特异性抗体结合后，使用来自Abcam (Cambridge, MA, USA)的一抗将膜在4 ℃温育过夜，包括：抗MITF (ab59232; 1∶1000)，抗TYR (ab61294; 1∶1000)和抗TRP-1 (ab83774; 1∶500)。然后将膜与二抗在室温下孵育1 h。通过增强型ECL化学发光试剂(Biodragon, Beijing, China)检测免疫反应条带，并在LAS-3000发光图像分析仪(Fujifilm, Tokyo, Japan)上显影。使用ImageJ软件进行分析。

3.6 数据分析

实验采用常规单向ANOVA和Dunnett多重比较检验以进行统计学分析。在Graphpad Prism软件(版本：7.05; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)上进行分析。数据代表来自3个独立实验的平均值。结果的重要性在统计学中表示为P值。统计P值根据显著性检验方法获得。通常，P<0.05被认为是显著的，P<0.01被认为非常显著，以此类推。其含义是由采样误差导致样本之间出现差异的概率小于0.05或0.01。在第4节的图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.0001。

4 脉冲光和连续光对黑素细胞影响的实验结果

4.1 光源照射对细胞活性的影响

图7为不同模式LED黄光照射后HEMs的细胞活性，数据表示为相对控制组变化的倍数，取三组重复试验平均值。结果显示，细胞增殖没有统计学上的显著变化，即无论是连续光还是脉冲光，590 nm LED黄光照射对黑素细胞均不产生显著的细胞毒性作用。

图7 不同模式LED黄光照射后HEMs的细胞活性Fig.7 Cellular activity of HEMs with different modes of LED yellow light irradiation

4.2 脉冲及连续模式对细胞黑素成熟的影响

实验进一步测量了连续和脉冲光照射对黑素生成的影响。黑色素是通过酪氨酸或3,4-二羟基苯丙氨酸的反应形成的生物色素。因此，比较了有光和无光处理的HEMs细胞中的黑色素含量和酪氨酸酶活性。如图8和图9所示，经过光照射后黑色素含量和酪氨酸酶活性均有降低。

结果显示，连续光和脉冲光照射后，细胞黑色素含量(n=3，p<0.01)和酪氨酸酶活性(n=3，p<0.05)之间存在显著差异。显而易见地，脉冲光照对黑色素含量和酪氨酸酶活性具有更强的抑制作用。黑色素含量与黑素小体的成熟密切相关。可以认为，脉冲LED黄光照射比连续光更能抑制黑素小体的成熟。

图8 不同模式LED黄光照射后细胞黑素含量Fig.8 Cellular melanin content with different modes of LED yellow light irradiation

图9 不同模式LED黄光照射后细胞酪氨酸酶活性Fig.9 Tyrosinase activity with different modes of LED yellow light irradiation

4.3 脉冲及连续模式对细胞黑素合成的影响

接下来通过研究关键的黑素生成酶在mRNA和蛋白质水平上的表达，探讨在连续和脉冲LED黄光照射条件下对黑素生成的影响。

(1) mRNA表达。如图10所示，连续光(n=3，p<0.01)和脉冲光(n=3，p<0.0001)照射均对TYR的mRNA表达有显著的抑制作用，其中脉冲光组的TYR mRNA表达与连续光组相比显著降低(n=3，p<0.05)。

图10 不同模式LED黄光照射后TYR mRNA表达Fig.10 TYR mRNA expression with different modes of LED yellow light irradiation

同样地，如图11所示，连续光(n=3，p<0.01)和脉冲光(n=3，p<0.0001)照射均对TRP-1的mRNA表达有显著的抑制作用，其中脉冲光组的TRP-1 mRNA表达与连续光组相比显著降低(n=3，p<0.05)。

图11 不同模式LED黄光照射后TRP-1 mRNA表达Fig.11 TRP-1 mRNA expression with different modes of LED yellow light irradiation

然而，如图12所示，MITF的mRNA表达在有无光照射的情况下未出现显著变化。

图12 不同模式LED黄光照射后MITF mRNA表达Fig.12 MITF mRNA expression with different modes of LED yellow light irradiation

(2) 蛋白质表达。如图13所示，连续光(n=3，p<0.05)和脉冲光(n=3，p<0.0001)照射均对TYR的蛋白表达有显著的抑制作用，其中脉冲光组的TYR 蛋白表达与连续光组相比显著降低(n=3，p<0.01)。

图13 不同模式LED黄光照射后TYR 蛋白表达及免疫条带Fig.13 TYR protein expression and immunological bands with different modes of LED yellow light irradiation

如图14所示，脉冲光(n=3，p<0.01)照射对TRP-1的蛋白表达有显著的抑制作用，脉冲光组的TRP-1 蛋白表达与连续光组相比显著降低(n=3，p<0.05)。

图14 不同模式LED黄光照射后TRP-1 蛋白表达及免疫条带Fig.14 TRP-1 protein expression and immunological bands with different modes of LED yellow light irradiation

与mRNA表达相类似地，如图15所示，MITF的蛋白表达在有或没有光照射的情况下同样未出现显著变化。

图15 不同模式LED黄光照射后MITF 蛋白表达及免疫条带Fig.15 MITF protein expression and immunological bands with different modes of LED yellow light irradiation

综上，经过不同照射模式处理后，TYR、TRP-1、MITF的mRNA表达和蛋白表达水平结基本一致，这些结果表明LED黄光照射能够显著抑制细胞内黑色素生成，并且抑制效果强弱与光照占空比明显相关。相同的频率、照射强度和剂量下，50%占空比的脉冲光照在降低黑素生成方面更为有效。

5 讨论

连续光和脉冲光如何影响细胞的机制尚未明确[26]。我们认为，一方面，这主要是由于相应疾病的差异和实验细胞的可变氧化还原水平的不同，使得结论分析更为复杂。另一方面，除了单一变量外，其他照明参数的控制也发生了变化。例如，许多研究中没有提到连续光照和脉冲光照条件下的平均辐照度是否保持一致。如要求平均辐照度相同，占空比50%的脉冲光的幅值是连续光的2倍。这一因素将直接影响在相同照射时间下的总剂量。因此，本实验中严格控制除占空比以外的其他可变因素，包括照射时间、平均功率、总剂量和脉冲频率。

实验结果表明，与无光照组相比，连续光和脉冲光照射未显著影响细胞活性。在这一前提下，进一步探讨了连续和脉冲两种不同光照模式对于黑素体成熟和黑素生成过程的抑制作用。观察到酪氨酸酶活性和黑素含量均在光照后降低，其中脉冲光照组的抑制作用更强，表明脉冲光照射下黑素体的抑制作用更强。此外，探讨了与黑素合成相关的关键酶在经过不同光照处理后基因和蛋白层面的表达，结果显示，黑素合成过程中的两种关键酶TYR和TRP-1的mRNA和相对蛋白表达受到脉冲光的抑制作用更强，表明50%占空比脉冲光相对连续光而言更能抑制黑素生成。

此前关于脉冲光和连续光功效讨论主要有两类研究：一类是体外细胞实验，一类是临床人体实验。Brodon等[23]通过实验得出结论：通过减轻皮肤黑色素的过滤效应，脉冲光比连续光更能改善皮肤色素沉着，本实验进一步发现，这一过程不仅是由于过滤效果，而且黑色素的成熟和合成本身会受到脉冲光更强的抑制作用。本实验结果与Barolet等[19]的结论一致，即脉冲光照射拥有更好的治疗效果。在本实验设计中，更加注重光源平均辐照度的控制，严格确保除占空比以外其他所有的变量(照射时间、平均辐照度、总剂量、频率、温度等)保持一致。此外除了目标物质含量(黑色素)，进一步探索了几种影响黑色素合成的关键酶在mRNA和蛋白质水平上的表达，试图通过此研究光照对黑色素含量的影响机制。

至于为什么脉冲光照射模式要优于连续光照模式，目前有几种可能的解释，主要包括：

1) 细胞可能需要时间用来吸收和处理光子[19]，以及避免细胞耗尽[24]，靶向分子/细胞可能有其自身特定的热弛豫时间。

2) 脉冲光照可能增强NO解离和ROS爆发[25]，从而增加线粒体的能量产生以参与细胞活动。

3) 可能存在通过“孔”的光的局部场增强，并且在特定频率下的脉冲光输出可减轻光吸收效应，导致更多的能量到达靶细胞[23]。

本实验中脉冲光比连续光更能抑制黑素合成，可能有以下的原因：

1) 脉冲光在转录水平层面以抑制TYR和TRP-1 mRNA合成的方式影响黑色素合成。

2) 脉冲光可能抑制黑素合成反应的关键酶和相关蛋白质的合成。

在这两种方式中，可以提出假设，在基因转录或蛋白质合成过程中可能存在“极限辐照度”。在实际辐照度高于极限辐照度的情况下，连续模式在同样的时间内能够提供更多能量，加快转录或合成的反应速度。

3) 酶的半衰期和脉冲持续时间之间可能存在某种重合，从而在瞬时功率更高的脉冲照射下，蛋白分解过程加快，TYR和TRP-1家族蛋白的含量降低，进一步影响黑素的合成过程。

此外值得注意的是，尽管TYR和TRP-1在无光、连续光和脉冲光模式之间具有显著差异，但MITF表达没有显示出显著变化。这可能是由于因为TYR和TRP-1直接的基因和蛋白表达直接受到光照影响，同时作为MITF的靶基因，TYR和TRP-1的编码基因直接受MITF调节，但相反的通路是否成立，即TYR和TRP-1表达是否影响MITF的表达，可能有待研究。

6 结论

本文设计并制造了一个590 nm的黄光LED装置，能够在连续和脉冲模式下保持平均辐照度不变。实验评估了不同光照条件下黑色素合成中的3种关键黑色素酶TYR/TRP-1/MITF的细胞活力、酪氨酸酶活性、mRNA和蛋白质表达，用来比较连续和脉冲光照射对黑素体的成熟和黑色素合成的影响。

结果显示连续和脉冲LED光照处理显著抑制了黑色素合成，其特征表现在mRNA和蛋白质水平上的TYR和TRP-1表达降低。与连续模式相比，脉冲光照射对黑色素合成具有更好的抑制作用，表现为更低的TYR和TRP-1基因和蛋白表达。由此得出结论，通过影响TYR和TRP-1 mRNA合成的转录水平以及通过合成或降解关键酶和相关蛋白，脉冲光能够更有效地抑制黑色素合成。

致谢:陈力主治医师支持和指导了本文的细胞实验。上海力兹照明电气有限公司制作了黄光LED装置。在此表示感谢。