贵州产灵芝HPLC指纹图谱研究

袁晓艳，张书山，王明阳，唐 颖，陈 萍

(1.遵义医科大学 药学院分析化学教研室，贵州 遵义 563099；2.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550000)

灵芝(Ganodermalucidum)，别名芝草、瑞草，泛指真菌门(Eumycota)灵芝菌科(Ganodermataceae)灵芝属(Ganoderma)的所有种类[1]。灵芝在我国有2 000多年的药用历史，具有增强人体免疫力、控制血压、调节血糖、保肝护肝以及改善睡眠等作用[2-3]。灵芝中含有多糖、三萜、核苷、生物碱等化学成分，其中灵芝多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、降血脂等功效，三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗HIV-1等作用[4-7]。目前对灵芝中的三萜类及多糖的含量测定已有文献报道[8]，但无法全面评价灵芝的质量。

我国灵芝资源丰富，分布于浙江、江西、贵州、云南、福建、海南等省，多为野生，生于栎树及其它阔叶树木桩上。近年来，随着灵芝需求的不断扩大，野生灵芝远远不能满足市场需求，许多省区已开始人工栽培[9]，目前，椴木栽培和袋料栽培是我国主流的两种灵芝栽培技术[10-14]。贵州省因具有特殊的高原地貌、凉爽的气候和茂密的森林植被等自然环境优势，是我国灵芝的优势产区。研究前期精选不同品种的6个灵芝菌株，并优选出其中灵芝多糖含量最高的灵芝菌株继续培养。为实现猕猴桃修剪枝生态循环利用，促进贵州灵芝生产向绿色环保方向发展，以修文猕猴桃树枝屑及栎树阔叶木屑为主料培养基按不同配比进行培养，培育出7个贵州灵芝菌株的子实体。前期研究表明不同品种及不同培养方式的灵芝多糖含量差异较大，其多糖含量在干灵芝中最低不足1.0%，最高可达5.9%。为了对灵芝进行更为全面的质量评价，本研究将对不同来源及不同培养条件下所获得13个贵州产灵芝进行HPLC指纹图谱分析，以期为贵州人工栽培灵芝提供质量评价依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂 T9双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；FA2004N分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；粉碎机(杭州九阳生活电器股份有限公司)；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；HPLC-Agilent 1100(美国安捷伦)。

乙酸、乙酸乙酯(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)；无水乙醇(成都市科龙化工试剂厂)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)；所用水为艾柯实验室超纯水。

1.2 材料 实验所用6个不同品种的灵芝菌株(F1-F6)均为贵州产灵芝，其名称及来源见表1，6个灵芝菌株均经过张玉金博士(遵义医科大学，生药学教研室)鉴定为灵芝样本。

表1 灵芝菌株编号与来源

实验所用猕猴桃修剪屑及栎树阔叶木屑培养的灵芝(1-7)由表1中的贵州产灵芝F2(S9)继续培养，猕猴桃树枝是由修文县谷堡园区提供的猕猴桃修剪树枝，用粉碎机粉碎成直径≤5 mm 的屑状颗粒备用；灵芝栽培袋规格为15 cm×32 cm×0.05 cm；阔叶木屑、麦麸、糖、过磷酸钙、石膏等材料在当地购买；所用原料中麦麸、糖、过磷酸钙、石膏原材料比例为定量比例(麦麸∶糖∶过磷酸钙∶石膏原=25∶1∶1∶1)，木屑和猕猴桃树枝屑为变量组合成7个试验配方培养出的灵芝(1-7)见表2。

表2 菌株编号1-7栽培料配方比例

2 方法

2.1 灵芝供试样品溶液的制备 准确称取粉碎后的灵芝10 g，以乙酸乙酯作为溶剂，乙酸乙酯(v)：灵芝(m)=10∶1浸泡过夜后，超声提取3次，合并提取液，过滤后减压浓缩得粗提物，粗提物以乙酸乙酯溶解后定容于25 mL容量瓶中，过0.22 μm滤膜备用。

2.2 色谱条件 Agilent HC-C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)；以0.5%乙酸水溶液(A)和乙腈(B)为流动相，梯度洗脱(0～15 min，5%～32% B；15～40 min，32%～57% B；40～60 min，57%～73% B；60～61 min，73%～75% B；61～71 min，保持在5% B)；柱温：25 ℃，检测波长：300 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密称取灵芝样品F2(即S9)样品，按“2.1”项下方法制备灵芝供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件下连续进样6次，计算得各共有峰的相对保留时间RSD<1.0%，相对峰面积RSD<3.0%，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性试验 精密称取灵芝样品F2(即S9)样品6份，按“2.1”项下方法平行制备灵芝供试品溶液6份，在“2.2”项下色谱条件下进样分析，计算得各共有峰的相对保留时间RSD<1.0%，相对峰面积的RSD<3.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取F2(即S9)样品，按“2.1”项下方法制备灵芝供试品溶液，以“2.2”项下色谱条件下分别于0、6、12、18、24 h进样，计算得各共有峰相对保留时间RSD<1.0%，相对峰面积RSD<3.0%，表明供试品溶液的各共有成分在24 h内稳定。

3 结果

3.1 贵州产灵芝HPLC指纹图谱的建立

3.1.1 HPLC指纹图谱 将不同来源及不同培养方式所获得的13个贵州产灵芝样品分别按照“2.1”项下方法制备灵芝供试品溶液，并按照“2.2”项下色谱条件进行分析，记录各样品色谱图，得到13个灵芝样本的的指纹图谱见图1，其中S1-S7分别为栎树阔叶木屑和猕猴桃枝屑不同比例培养所得的贵州产灵芝1-7号样品(见表2)，S8-S13分别为不同来源的贵州产灵芝F1-F6(见表1)。

图1 13批贵州产灵芝样品HPLC指纹图谱

3.1.2 相似度分析 以13批次的贵州产灵芝样本的HPLC指纹图谱为基础，导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价(2012版)》进行数据处理，以灵芝F2(即S9)为参照图谱，时间宽度设为0.20，进行多点校正后，建立共有模式，共确定29个共有峰，并生成贵州产灵芝的共有对照指纹图谱R，见图1。22号峰(保留时间45.364min)与其它相邻峰分离度较好，峰面积较大，故以其为参照峰S(见图1)，计算其它共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果分别见表3～4。将波动较大的保留时间转变成稳定性较好的相对保留时间，有助于建立各样品统一的定性依据，本研究中，各共有峰相对保留时间偏差均很小，其RSD值在0.000%～0.333%。相对峰面积是色谱指纹图谱定量的依据，本研究中，13批贵州产灵芝的29个共有峰的相对峰面积分布在一个相对较宽的范围内，最大RSD值达到63.12%。其中14号和20号峰变化幅度较大，相对峰面积的变化客观反映了化学成分的批间差异。

表3 13批贵州产灵芝样本共有峰的相对峰面积

表4 13批贵州产灵芝样本共有峰的相对保留时间

将对照图谱和13批次样品色谱图导入“2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，以各批次贵州产灵芝样品色谱图与对照指纹图谱R进行相似度比较，相似度结果见表5。由相似度结果可知，13个贵州产灵芝样本间的差异较小，均大于0.90，表明不同来源及不同培养方式的灵芝质量具有较高的一致性，人工培育的灵芝样本与野生灵芝样本并无明显差别。不同品种灵芝样本中，F6(S13)与其它灵芝品种差异较大，其相似度为0.937，说明大红巨芝与其它灵芝样本之间差异略大。人工栽培灵芝样本中，仅灵芝1(S1)相似度略低，为0.915，说明，灵芝人工培育过程中，不添加猕猴桃枝屑培育的灵芝样本与添加猕猴桃枝屑培育的灵芝样本之间有较大的差异。

表5 13批贵州产灵芝样品指纹图谱相似度

3.2 聚类分析 聚类分析能够从样本数据出发，自动进行分类。本研究以HPLC 批纹图谱共有峰相对峰面积作为特征指标，采用SPSS22.0统计软件中的组间连接法，以夹角余弦作为度量标准，进行聚类分析，结果见图2。由图2可知，当类间距离为30时，13批贵州产灵芝被分为2大类：F6(S13)为一类，其余12个灵芝样本聚为一类，当类间距离为20时，13批贵州产灵芝可分为三类，F6(S13)为一类，以不同培养料培养的灵芝1(S1)为一类，其余11个样本聚为一类，这与相似度计算结果基本一致，可以相互验证。

图2 13批贵州产灵芝样品的聚类分析结果

4 讨论

简单的测定一个或几个有效成分含量为主的传统的质量分析方法不能真正地反映灵芝的品质。因此，建立全面、系统而又特征地反应灵芝的化学成分的指纹图谱，可以为贵州灵芝的质量评价和控制提供一个有效的参考方法，更有利于推广贵州省优质的道地灵芝栽培研究。本研究建立了13批不同来源及不同培养方式的贵州产灵芝的HPLC指纹图谱，共标定29个共有峰，并利用相似度评价和聚类分析对灵芝的HPLC指纹图谱进行研究。13种灵芝间的相似度均高于0.90，表明不同来源的野生灵芝之间差异不大，人工培养的灵芝与野生灵芝间品质具有良好的一致性。聚类分析结果表明，野生灵芝F6及人工培养的灵芝1分别归为一类，其它11种灵芝归为一类，该结果与相似度计算结果基本保持一致，可能是灵芝生长环境不同及培养方式不同产生的差异。本研究为贵州灵芝的质量控制提供了依据，将更有利于推广贵州省优质的道地灵芝栽培研究，为创建贵州灵芝品牌提供依据。