鼠伤寒沙门氏菌在肿瘤免疫治疗中的应用研究进展

邬玉芹，冯智才，陈建强

(1.中南大学湘雅医学院附属海口医院放射科，海口 570208； 2.中南大学湘雅三医院烧伤整形外科，长沙 410013)

目前肿瘤的主要治疗方式是手术、放疗及化疗的综合治疗[1]，虽然在一定程度上可以缓解患者疼痛并使肿瘤体积缩小，但是它们并没有提高晚期及转移患者的寿命以及改善预后。放疗和化疗不仅会造成正常组织损害，而且能降低患者免疫力，从而导致患者对真菌、细菌及病毒的易感性增加和其生活质量下降[2]。正是由于这些不足的存在，癌症研究人员近十几年来研发出了一种新型癌症治疗法即细菌介导的肿瘤疗法，用来解决目前临床上存在的问题。其具有高度特异性及靶向性，且对患者正常组织不具有损伤性。

细菌免疫疗法是利用体外注射工程化细菌或者细菌作为载体表达肿瘤相关抗原，特异性并靶向性地消除特定的实体瘤及其转移病变，同时保留正常组织，从而达到治愈的目的。细菌介导的肿瘤疗法可为大多数实体瘤和转移患者提供可持续的治疗方法，并正朝着可行的解决方案迈进。其已在各种临床前肿瘤模型获得了有希望的结果。最近FDA批准了DC疫苗Sipleucel-T[3]和免疫检查点调节治疗药CTLA-4单抗Ipilumimab[4]，分别用于前列腺癌、转移性黑色素瘤，与传统治疗方法相比，它们取得较好的效果且不良反应降低。但就目前的形式而言，细菌介导的肿瘤免疫疗法必须克服免疫耐受、肿瘤微环境的免疫抑制以及对非靶向组织的严重自身免疫反应等障碍。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar typhimurium，ST)能引起机体产生免疫力从而具有抗肿瘤性，本文就细菌免疫治疗现状、鼠伤寒沙门氏菌的生物学特征及其在临床中的应用研究进展作一综述，探讨鼠伤寒沙门氏菌免疫疗法治疗肿瘤的优势与机制，以及对未来的展望。

1 细菌免疫治疗现状

当代医学关于细菌免疫治疗实体瘤及晚期转移患者的研究比较少，不过近十几年在这方面的研究开始逐渐增多。目前细菌介导的肿瘤治疗已在各种临床前肿瘤模型取得了较好的结果，其是现代肿瘤治疗的新型治疗策略。1868年，德国医生WILHELM BUSCH首次用细菌治疗癌症患者。WILLIAM COLEY将由灭活的脓性链球菌和粘质沙雷氏菌组成的Coley’s毒素，用于肾癌，卵巢癌和肺癌等患者身上，取得了较好的疗效[5]。但基于当时缺乏对细菌介导的肿瘤治疗的深入认知且随着放、化疗的出现，导致细菌在临床使用中不受重视。值得庆幸地是，减毒牛分枝杆菌(BCG)一直在临床上用作膀胱癌的免疫疗法并取得了较好的临床效益[6]。细菌激发人体先天免疫反应，导致抗原呈递细胞的激活及免疫细胞幕集并进一步分泌促炎因子如TNF-α、IL-1β[7]，且细菌对实体瘤的坏死区有定植作用，这些抗微生物反应集中于肿瘤，从而具有抗肿瘤作用[8]。这正是细菌免疫治疗的优势，其解决了化疗和放射对肿瘤的不完全渗透和对健康组织的非特异性损伤[9]。当前，能通过基因工程定制定细菌菌株并且已经构建了表达肿瘤相关抗原(TAA)的重组细菌，用于持久激活肿瘤特异性CTL，解决了细菌诱导的急性炎症短暂性的缺点。目前运用最多的细菌是单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)和鼠伤寒沙门氏菌及大肠杆菌，他们对实体瘤的坏死区具有较好的定位及特异性，从而使它们成为当前细菌免疫治疗研究的焦点，并且在肿瘤动物模型中取得了一定的成果。如减毒鼠伤寒沙门氏菌已证明在结直肠癌、胶质母细胞瘤模型有效。但是细菌免疫治疗也有不足之处，其不能定向定植和消除实体瘤的可存活区域。

2 鼠伤寒沙门氏菌的生物学特征

鼠伤寒沙门氏菌进入宿主后首先侵入人体肠黏膜并分泌内毒素，如脂溶素(LPS)，其是TLR4通路的天然配体[10]，利用此通路感染宿主细胞，并最终被吞噬细胞捕获。目前已有研究[11]表明，减毒鼠伤寒沙门氏菌对多种恶性实体瘤具有高度靶向性，利用独立的减毒鼠伤寒沙门氏菌或用其作为基因载体可以治疗多种恶性实体瘤。对于治疗前出现过鼠伤寒沙门氏菌感染的患者，细菌载体对肿瘤免疫治疗的疗效会受到其影响[12]。无须担心的是，其可以通过反复加强来减轻先前存在的免疫对细菌递送抗原反应的影响并将其降低到最小[13]。在淋巴器官中，巨噬细胞吞噬鼠伤寒沙门氏菌而感染，其在巨噬细胞吞噬体中被保持隔离并慢慢生长及复制[14]。单核增生细胞李斯特菌同样能够逃逸吞噬体到胞质溶胶中，与鼠伤寒沙门氏菌的区别在于，其不是在空泡中复制及生存，而是在胞质溶胶中迅速分裂并高效地将抗原递送到免疫细胞[15]。有研究[16]表明，对于表达相同抗原，单核增生细胞李斯特菌比鼠伤寒沙门氏菌载体呈递抗原作用更强，并且引起更强大的免疫应答及抗肿瘤效果。有趣的是，TAKAHASHI等[17]通过使用Ⅲ型分泌系统改善沙门氏菌来增强其抗原呈递作用及抗肿瘤效力。目前沙门氏菌的疫苗在临床试验中已经得到了证实[18]。但在这之前关键是需要了解它们的细胞定位及诱导免疫的机制。鼠伤寒沙门氏菌分泌内毒素即脂溶素，其与Toll样受体即TLR4受体结合，识别细菌病原体相关分子模式(PAMP)，引起一系列的生物学反应，诱导大量促炎细胞因子释放，如肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1β等，导致针对病原体和肿瘤的有效细胞免疫应答。但是在引起有效的免疫应答之前，鼠伤寒沙门氏菌必须逃逸吞噬细胞的杀伤。为了躲避吞噬体，宿主细胞内细菌分泌多种毒力因子，如防御素、活性氧和氮中间体，吞噬溶酶体微生物机制及微环境的pH值恰好能被这些微小因子改变，进一步导致溶酶体活性的改变。其就是利用抑制吞噬体-溶酶体融合来防止吞噬体的酸化，从而构建一个无害的液泡，细菌可在其中生存和分裂增殖。某些研究者已经利用鼠伤寒沙门氏菌这一特性，在phoP基因座中编码毒力因子诱导形成较多空泡，细菌在这些空泡中能够长久存在和持续生长[19]。

3 鼠伤寒沙门氏菌可用于目标肿瘤的免疫治疗

总所周知，恶性实体瘤存在异常血管、缺氧、坏死区域这三大特点[20]。恶性实体瘤这三大特征恰好能吸引厌氧性或兼性厌氧细菌，例如双歧杆菌[21]、沙门氏菌[22]、埃希氏菌[23]、梭菌[24]和李斯特菌[25]。从而导致肿瘤组织中细菌大量集聚及增殖，甚至比其他器官如肝脏和脾脏中的细菌数量高出一千倍以上[26]。另一原因导致细菌优先靶向肿瘤内部是肿瘤微环境存在免疫抑制性，细菌能够逃避免疫系统攻击。有研究[27]表明鼠伤寒沙门氏菌在结肠癌模型中显示出较高的定植率，而且抑癌作用较明显。首先，鼠伤寒沙门氏菌是兼性厌氧菌，其除了可以靶向恶性肿瘤缺氧坏死区外，还能够定植血液较丰富的肿瘤活体部分[28]。其次，ST在肿瘤组织内浓度滴度远远超过正常组织。另外，已有研究[29]表明可以通过体外敲除鼠伤寒沙门氏菌合成某些核酸或氨基酸的基因而使其毒力减弱或者利用其作基因载体产生针对恶性实体瘤微环境的菌株。最新研究[30]表明，几种减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株抑制肿瘤生长，目前在临床上，VNP20009属于鼠伤寒沙门氏减毒菌株，其purI和msbB基因被敲除，应用于转移性黑素瘤和肾细胞癌的患者并取得较好的效果。在黑素瘤或者结肠癌小鼠模型中，给小鼠腹腔或者皮下注射ST各种减毒营养缺陷型菌株，观察肿瘤组织细菌集聚明显多于其他组织；而另一种A1-R减毒菌株既能抑制各种小鼠实体瘤模型中肿瘤的生长甚至消退，又能增加肿瘤组织对化学疗法的敏感性[31-32]。

4 鼠伤寒沙门氏菌在临床治疗中的应用

目前已证实了减毒ST菌株在各种小鼠模型中能抑制原发性肿瘤和转移瘤生长，但它在临床上运用的效果非常有限。20世纪初，VNP20009被运用于黑色素瘤患者，只是在少数转移患者中观察到了少量细菌定植，完全没有观察到抗肿瘤效果[33]，这可能是由于VNP20009在血液里被清除较快引起。其与皮下种植结肠癌小鼠模型中观察的结果完全相反，如静脉注射不久后即可在肿瘤组织内发现ST高浓度定植和肿瘤微环境分泌大量促炎细胞因子。另外部分原因可能是人体表达Nramp1蛋白，而小鼠不表达，从而使小鼠更易受ST感染。Nramp1是一种重要的细菌抗性蛋白，在吞噬溶酶体膜中表达，可调节巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞中铁的水平。由于在使用VNP20009作为单一疗法的临床试验中观察到令人失望的结果，故在2017年，有研究者[34]利用Nivolumab与Ipilimumab联合治疗黑色素瘤并观察到较好的疗效，证实了联合用药比单独用药有更好的疗效。沙门氏菌具有特殊的机制，允许进入和扩散在上皮细胞和其他非吞噬细胞内。ST编码Ⅲ型分泌系统(TTSS)通过肌动蛋白的重组，负责生产与宿主细胞膜相互作用的衔接复合物并促进细菌递送重要的蛋白质。目前，远程工程化沙门氏菌TTSS在癌症和传染病的独特疫苗抗原递送系统，取得了良好的结果。这一过程不仅有助于ST在肿瘤微环境中持续较长时间，允许细菌逃避免疫，利于其抗肿瘤功效，同时该系统使ST成为DNA，毒素和其他治疗药物的理想传递载体，使分子进入肿瘤细胞。

鼠伤寒沙门氏菌可以作为cDNA、mRNA、肿瘤相关抗原(TAA)及细胞因子递送载体并目前已经运用至各种动物癌症模型。如表达IL-2的ST既成功运用于黑色素瘤模型，又运用于神经母细胞瘤模型，并且明显观察到对肿瘤的抑制作用。肠炎沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌已用于将肿瘤抗原作为DNA质粒和蛋白质递送至免疫系统。由于沙门氏菌是革兰氏阴性的，因此可以构建高度减毒的菌株以降低与LPS相关的毒性[35]。此外，ST可以被修饰用于肿瘤特异性前药转化，TAPET-CD重组ST在小鼠结肠癌模型中取得了成功[36]。总之，这些研究为减毒ST的替代使用提供了强有力的支持，其可严格地作为肿瘤免疫治疗的菌株。

目前正在大力探索鼠伤寒沙门氏菌作为治疗性抗肿瘤的潜力。ST具有将治疗方式传递到肿瘤内部的能力且ST可高度操作，具有任意组合治疗方案。其可能会成功地治疗侵略性和转移性实体瘤，给晚期恶性肿瘤患者的治疗带来希望。