白族药用植物长果颈黄芪根的多糖含量测定

1.大理大学药物研究所，云南 大理 671000；2.大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000

黄芪为滋补类传统中药，性微温、味甘，主要含黄芪皂苷类、多糖类和黄酮类生物活性物质，具有增强和调节机体免疫功能、促进机体代谢和抗疲劳等作用，在抗肿瘤、抗病毒等方面也有显著功效[1-4]。黄芪药材原植物为黄芪属植物膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.或蒙古黄芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao[5]，这两种植物在云南无天然分布。然而，由于云南在地理、气候等方面的多样性，致使该地区黄芪属植物种类十分丰富，许多分布于云南的黄芪属植物在民间被当作草药广泛应用，部分种类甚至被用作正品黄芪代替品[1]。其中，在《中华本草》上称之为“野黄芪”的长果颈黄芪(A.englerianus)就被认为具有与黄芪相似的功效[1]。长果颈黄芪主要分布于云南和西藏东南部，生于海拔2000～3700米的山坡林缘，是少数几个在大理及周边地区具有广泛分布的黄芪属植物之一。民间调研发现，大理白族地区亦将其代黄芪药用，但对其现代研究认识却非常有限。本团队前期研究发现，该植物富含具有杀寄生虫和抗氧化活性的黄酮等酚性成分，以及甾醇类化合物[6-9]。另据报道，黄芪多糖是黄芪的有效成分之一，现代药理研究表明其具有增强机体免疫功能、改善心血管功能、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗动脉粥样硬化、降血脂、肝保护、神经保护以及治疗糖尿病等作用[10,11]。为进一步考察长果颈黄芪药用品质相关物质基础，本文采用硫酸-蒽酮法对其多糖含量进行了测定，为更好地开展白族药用植物研究以及开发长果颈黄芪资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 UV-T6紫外可见分光光度计(北京普析通用有限责任公司)；80-2台式低速离心机(上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

葡萄糖(批号：XK13-001-2001-164II，成都化学试剂厂)；浓硫酸(批号：XK13-201-00370 008II重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂)；蒽酮(批号：20071101，上海化学试剂采购供应五联化工厂)。

长果颈黄芪(AstragalusenglerianusUlbr.)的根于2011年11月采自云南大理苍山，由中国科学院昆明植物研究所向春雷博士鉴定，植物标本(20100928-1b)存放于大理大学药物研究所。8个正品黄芪样品(见表1)2011年7月购于大理白族自治州主要药材销售公司，经大理大学周浓副教授、肖朝江博士鉴定为正品黄芪基原植物之一膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge。

表1 8个市售黄芪样品来源一览表

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄糖标准液的配制 精密称定 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品 25 mg，加适量水溶解，转移至250 mL容量瓶中，加水至刻度并摇匀，得对照品溶液(0.1 mg/mL)。

1.2.2 硫酸蒽酮试液的配制 精密称取蒽酮 0.5 g，加80%的硫酸溶液500 mL使溶解，摇匀，即得。

1.2.3 标准曲线的制备 分别精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，置10 mL具塞试管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，摇匀，置水浴中加热15min，取出，放入冰浴中冷却15min，以相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法，在625 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 供试品溶液的配制 分别精密称取上述黄芪样品约2 g，精密称定，置索氏提取器中，加水80 mL，热回流提取至提取液无色，提取液转移至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取20 mL，加入乙醇180 mL，摇匀，4 ℃放置12 h，取出，离心10 min(3000 r/min)，倾去上清液，沉淀再加适量乙醇反复洗涤、离心2次，最后加水溶解并转移至50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液10 mL至50 mL容量瓶中，加水定容摇匀，即得。

1.2.5 含量测定 精密量取供试品样品溶液各 2 mL，分别置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的重量，计算，即得(多糖含量以无水葡萄糖计)。实验重复3次。

2 结果

2.1 标准曲线及其回归方程的建立 按上述实验方法制作标准曲线如图1所示。以吸光度值对葡萄糖浓度进行线性回归，得回归方程：y=0.033x-0.0148(2.5～25μg/mL，r=0.9991)；表明方程的线性非常好。

2.2 长果颈黄芪和8个正品黄芪样品多糖含量 按上述实验方法测得9个黄芪样品中的多糖含量如表2所示，所有正品黄芪样品的多糖含量均在4%以下，而大理野生的长果颈黄芪的多糖平均含量却高达15.44%。多样本均数两两比较的单因素方差分析(α=0.05，SPSS，版本19.0)结果表明：样品2和8之间无统计学差异(P>0.05)；样品3、5和7之间无统计学差异(P>0.05)；这两组样品之间以及与其他样品之间均有统计学差异(P<0.05)。

2.3 重复性试验 精密称取同一黄芪样品，按“1.2.4”和“1.2.5”项下方法，重复测定6次，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的量，计算得RSD为0.12%，表明该方法重复性良好。

2.4 稳定性试验 精密量取同一黄芪样品溶液，按标准曲线项下方法显色，分别在0、10、20、30、40、50、60、120 min时测定吸光度，实验重复6次，计算得RSD为0.26%，表明样品溶液在2 h内非常稳定。

2.5 加样回收率试验 精密称取同一黄芪样品约1 g，按样品制备方法制备供试品溶液6份，各取1 mL，分别置6个10 mL具塞试管中，每管再精密加入对照品溶液1.0 mL，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的重量，计算回收率(见表3)。样品回收率为95.94%，RSD为1.19%，表明本法准确可行。

表2 黄芪样品多糖含量测定结果

注：9和10为两批次长果颈黄芪。

3 讨论

实验结果表明，白族药用植物长果颈黄芪根多糖平均含量高达15.44%，与正品黄芪(平均2.81%)差异十分显著，约5.5倍于正品黄芪。仅从多糖含量角度来看，大理野生长果颈黄芪的品质可能优于正品黄芪。但多糖结构复杂，因此该差异是否能影响黄芪的正常功效，有待进一步研究。实验结果还发现大理州市售黄芪的多糖含量在1.81%～3.86%之间，表明各销售公司的黄芪在品质上存在一定差异。

表3 加样回收率试验结果

另外，本实验采用的方法为《中国药典》灵芝项下用于灵芝多糖含量测定的硫酸-蒽酮法[5]。研究结果表明该法在测定黄芪多糖含量测定中显示出较高的精密度，以及较好的稳定性和回收率，因此该法亦可用于黄芪药材、炮制品以及含黄芪制剂的多糖含量控制。