壮药白花九里明干预心肌损伤和保护心肌细胞作用的研究

右江民族医学院，广西 百色 533000

白花九里明[Blumeamegacephala(Randeria)]属菊科植物，为广西壮族民间常用药，外敷用于治疗跌打肿痛，内服用于治疗风湿骨痛、月经不调、产后流血[1-2]。近年研究文献报道，白花九里明具有镇痛消炎、护肝止血、降压升糖等作用[3-7]。而白花九里明对心肌缺血缺氧损伤方面影响未发现有文献报道，本实验采用垂体后叶素制备小鼠急性心肌缺血缺氧损伤模型，以白花九里明民间用量[1-2]换算成小鼠用量[8]给小鼠灌胃，研究白花九里明对心肌损伤的干预保护作用及作用机制，并与临床抗心绞痛药物硝酸甘油[9]的保心作用相比较，为白花九里明的利用与开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级KM小鼠60只，雌雄各半，体质重25～35 g，由广西右江民族医学院动物实验中心提供(实验动物使用许可证号：SYXK桂2017-0004，实验动物生产许可证号：SCXK桂2017-0003)。小鼠饲养环境为室温18～22 ℃、湿度 50 %～60 %、日光照 12 h。实验前适应性喂养1周。

1.2 药材、药品、试剂和仪器 白花九里明采于广西百色市郊(经右江民族医学院民族教研室覃道光教授鉴定为白花九里明植物)，晒干备用。硝酸甘油(北京益民药业有限公司，批号：20150314)；垂体后叶素注射液(安微宏业药业有限公司，批号：110311)；0.9%氯化钠注射液(广西裕源药业有限公司，批号：L16062904)；氨基甲酸乙酯(成都市科龙化工试剂厂，批号：20161101)；甲醛(烟台市双双化工有限公司，批号：20170701)；TP定量测试盒、AST测试盒、SOD测试盒、MDA测试盒 (南京建成生物工程研究所，规格：96T，批号分别为20171130、20171202、20171204、20171201)。多功能酶标仪(上海壹侨国际贸易有限公司，型号TriStar LB941)；心电图机(广州市艾迪科逊医疗器械有限公司，型号：ECG-6511)，数码显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司，型号：BA2100igital)；离心机(上海安亭科学仪器厂，型号；TGL-16G)；手持台式两用均质器(PRO Scientific Inc Oxford CT USA，型号：PR0200)；三用恒温水箱(江苏金坛宏凯仪器厂，型号：HH-W600)。

1.3 白花九里明提取液的制备 将60 g白花九里明干草加入30 ℃左右的温水2000 mL浸泡1 h，文火煮沸1 h，16层纱布过滤，保留滤液；滤渣再加入30℃左右的温水2000 mL文火煮沸1 h，16层纱布过滤，两次滤液合起用文火隔水浓缩至100 mL(相当于生药600 mg/mL)，冷却后放入4℃冰箱保存，用时以双蒸水配制成低浓度和中浓度(150 mg/mL、300 mg/mL)的白花九里提取液。每5天提取1次。

1.4 动物分组与给药方法 取60只健康SPF级KM小鼠随机均分为6组。正常对照组和模型对照组(给予0.9%氯化钠注射液灌胃)，硝酸甘油组(给予13 mg/mL灌胃)，白花九里明提取液低、中、高浓度组(分别给予150、300、600 mg/mL灌胃)；正常对照组给予0.9%氯化钠注射液腹腔注射，其余各组给予垂体后叶素注射液0.26U/mL腹腔注射；灌胃和腹腔注射的量均按小鼠 10 mL/kg体质重计算，每天1次，连续15 d。

1.5 心电图检测 小鼠于末次用药前禁食12 h、禁水2 h，末次用药后用20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，通过心电图机描记药后10 min的心电图肢体Ⅱ导联波型。由同一人检测心电图各波段的情况。

1.6 小鼠心肌匀浆制备及心肌组织病检 于心电图检测后迅速将小鼠剖胸取心脏，取右心组织放入冰冻0.9%NaCl溶液试管中用匀浆机匀浆，制成10%的心肌匀浆离心分离出上清液；取左心浸泡于10%甲醛溶液固定 30 min，再脱水、石腊包埋、HE染色制备组织切片，用数码显微镜检查心肌组织结构并摄像。

1.7 小鼠心肌总蛋白(TP)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的测定 取小鼠心肌匀浆上清液，分别用TP定量测试盒、AST测试盒、SOD测试盒、MDA测试盒按说明书操作，用酶标仪检测出心肌中TP、AST、SOD、MDA的浓度。

2 结果

2.1 各组小鼠心电图检测结果比较 P波时限：白花九里明中浓度组和高浓度组明显大于正常对照组(P<0.01，0.05)，模型对照组明显小于其余各组(P<0.01)，硝酸甘油组、白花九里明低浓度组和正常对照组的两两比较无统计学差异(P>0.05)。QRS波时限和P-R段时限各组间两两比较无统计学差异(P>0.05)。模型对照组的J点上移明显高于其余各组(P<0.01)，其余各组J点上移的两两比较无统计学差异(P>0.05)。正常对照组的心率明显低于其余各组(P<0.01，0.05)，而其余各组间的心率两两比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

组别P波时限/msQRS波时限/msP-R段时限/msJ点上移/μv心率/次/min正常对照组18.00±1.3346.00±3.066.00±0.670417.30±54.03模型对照组9.00±1.63b45.00±4.7710.00±2.6975.00±12.36b616.60±27.20b硝酸甘油组22.00±2.13d44.00±3.068.00±1.532.50±2.50d571.10±36.94b白花九里明低浓度组21.50±2.36d42.00±2.008.50±1.5015.00±6.67d606.50±38.67b白花九里明中浓度组24.50±2.17ad42.00±2.006.50±1.507.50±3.82d577.80±27.32b白花九里明高浓度组26.00±2.77bd43.00±3.356.00±0.675.00±3.33d538.60±25.89a

注:与正常对照组比较，aP<0.05,bP<0.01; 与模型对照组比较，dP<0.01。

2.2 各组小鼠心肌TP、AST、SOD、MDA检测结果比较 正常对照组、模型对照组、硝酸甘油组、白花九里明低浓度组的TP浓度、AST浓度和SOD活性两两比较无统计学差异(P>0.05)；白花九里明中浓度组的TP浓度明显高于正常对照组、硝酸甘油组、白花九里明低浓度组(P<0.05)，而SOD活性明显低于这些组(P<0.01)；白花九里明高浓度组的TP浓度明显高于其余组(P<0.01)，而SOD活性明显低于其余组(P<0.01)；白花九里明中浓度组与高浓度组的AST浓度无统计学差异(P>0.05)，而均明显低于其余各组(P<0.01)。白花九里明高浓度组和正常对照组的MDA比较无统计学差异(P>0.05)，而又明显低于其余组(P<0.01，0.05)；白花九里明中浓度组的MDA明显低于白花九里明低浓度组(P<0.05)。见表2。

组别TP/μg/mLAST/U/LSOD/U/mLMDA/nmol/mL正常对照组0.54±0.02210.89±17.73415.21±18.878.80±1.17模型对照组0.59±0.04200.37±16.24376.20±17.8319.95±1.19b硝酸甘油组0.54±0.03204.63±14.43420.75±26.8118.15±1.80b白花九里明低浓度组0.54±0.01190.35±7.10405.91±10.9722.35±1.96b白花九里明中浓度组0.70±0.05aeg139.79±17.22bdfg322.57±26.81bfh17.32±1.67bg白花九里明高浓度组1.06±0.10bdfhy104.52±8.75bdfh220.50±24.17bdfhy12.51±0.85dehx

注: 与正常对照组比较，aP<0.05,bP<0.01; 与模型对照组比较，dP<0.01；与硝酸甘油组比较:，eP<0.05,fP<0.01；与白花里明低浓度组比较，gP<0.05,hP<0.01；与白花里明中浓度组比较，xP<0.05,yP<0.01。

2.3 各组小鼠心肌组织切片检查结果 正常对照组心肌细胞结构清晰，无变性坏死；模型对照组心肌细胞结构模糊而肿胀、数量明显减少，胞质疏松，胞核数量明显减少，心肌细胞间毛细血管明显扩张，细胞变性坏死区域明显；硝酸甘油组、白花九里明低浓度组和中浓度组的心肌细胞结构优与模型对照组，心肌细胞结构较为清晰，心肌细胞质疏松程度、细胞核数量、心肌细胞间毛细血管扩张和变性坏死区域等均有较大的改善；白花九里明高浓度组的心肌细胞结构清晰，没有明显变性坏死和毛细血管扩张现象，与正常对照组心肌细胞结构表达相接近并明显优于白花九里明低浓度组和中浓度组。如图1所示。

3 讨论

硝酸甘油是临床用于治疗心绞痛的药物，常以舌下含服给药，由于舌下静脉丰富含服的药物易通过静脉吸收进入血液[9]。本研究考虑到小鼠舌下含服不易实现，采用灌胃方式给药，但消化道静脉位于黏膜层下较深不象舌下静脉表浅暴露，消化道黏膜层外还有大量粘稠的粘液覆盖，而且消化道内还存在大量的消化液，考虑到这些因素会降低药物吸收，因而本研究用舌下含服10倍药量给硝酸甘油组小鼠灌胃作对照。

氧自由基可攻击机体组织细胞造成损伤，SOD是组织细胞抗氧化酶能消除氧自由基，MDA是脂质过氧化产物，测定MDA含量变化能反映组织细胞脂质过氧化物程度并间接反映组织细胞被氧自由基损伤程度[10]。垂体后叶素直接作用于内脏小动脉使之收缩而减少组织器官的血流量[9]。AST是胞内酶，主要存在于心肌细胞参与合成蛋白质[11]。

心电图的实验结果显示：模型对照组与正常对照组相比J点出现明显上移，提示本实验应用垂体后叶素成功制备心肌缺血模型[12]。硝酸甘油组和白花九里明低、中、高浓度组的J点与正常对照组比较无统计学差异而明显低于模型对照组，提示硝酸甘油组和白花九里明都能改善垂体后叶素引起的心肌缺血状况；硝酸甘油组和白花九里明低、中、高浓度组的心率与模型对照组比较无统计学差异而明显高于正常对照组，提示硝酸甘油组和白花九里明都不能对抗垂体后叶素引起的心率加快。实验结果还显示：① 正常对照组的MDA明显低于其余各组，提示其余各组的心肌组织细胞发生脂质过氧化；而模型对照组的心肌组织切片结果显示，心肌细胞结构模糊而肿胀、数量明显减少，胞质疏松，胞核数量明显减少，心肌细胞间毛细血管明显扩张，细胞变性坏死区域明显，提示垂体后叶素可引起心肌细胞损伤。② 硝酸甘油组的TP、AST、SOD与正常对照组比较无统计学差异，但MDA明显高于正常对照组而与模型对照组比较无统计学差异，其心肌组织切片结果显示各项指示明显优于模型对照组而趋向近于正常对照组；结合硝酸甘油组心电图表现并提示：硝酸甘油能改善垂体后叶素引发的心肌缺血缺氧和氧自由基损伤。③心肌TP浓度随着白花九里明浓度升高而升高、心肌AST、SOD、MDA浓度随着白花九里明浓度升高而下降，白花九里明低浓度组的TP、AST、SOD浓度和白花九里明高浓度组的MDA浓度与正常对照组比较无显著性差异；提示：白花九里明促进AST参与蛋白质合成而表现为心肌AST降低和TP升高为损伤组织细胞的修复提供原料，白花九里明促进SOD消除心肌组织细胞生脂质过氧化对心肌组织细胞的损伤而表现为心肌SOD、MDA浓度下降。同时心肌组织切片结果显示：随着白花九里明浓度的增加而心肌细胞损伤和心肌细胞间毛细血管扩张程度均越低，白花九里明高浓度组的心肌切片与正常对照组无明显区别；提示：白花九里明保护心肌组织细胞的正常结构。再结合心电图表现提示白花九里明能改善垂体后叶素造成的心肌缺血缺氧状态。从这些结果分析说明：白花九里明可对抗垂体后叶素造成的心肌细胞缺血缺氧和氧自由基损伤，促进蛋白质合成，这些作用随着白花九里明浓度增加而增强。

综上所述，垂体后叶素可引起血管收缩[9]、氧自由基增多而造成心肌细胞缺血缺氧和损伤；硝酸甘油改善心肌细胞缺血缺氧和损伤；白花九里明能改善心肌细胞缺血缺氧、干预氧自由基对心肌细胞损伤、促进心肌细胞自我修复作用，这些作用与白花九里明消除氧自由基、解除血管收缩[6]、促进蛋白质合成有关，白花九里明的这些作用存在量效正相关；高浓度的白花九里明改善心肌细胞缺血缺氧损伤效果与硝酸甘油相当。

通过本研究得出的结论对临床用药有一定的指导意义，白花九里明具有改善心肌细胞缺血缺氧、抵抗氧自由基对心肌细胞攻击损伤、促进心肌细胞自我修复作用，因此有望成为治疗心肌缺血缺氧的药物。