基于网络药理学方法分析小半夏汤药效物质及作用机制

宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春 336000

小半夏汤出自《金匮要略·呕吐哕下利病脉证治》第12条“诸呕吐，谷不得下者，小半夏汤主之”[1]。全方由半夏和生姜两味药组成。半夏温燥，功在涤痰化饮，降逆止呕，为治饮病之要药；生姜辛散，温中降逆，消散痰饮[2]。两药互相配伍，为后世“见呕止呕”治疗呕吐的祖方[1]。现代药理学研究表明半夏具有镇吐、抗肿瘤、抗心律失常、抗炎、降血脂、镇咳及糖皮质激素样作用[3-4]。生姜主要含有挥发油、姜辣素和二苯基庚烷3大类成分，具有抗氧化、改善脂质代谢、降血脂、改善心脑血管系统功能、抗炎、抗肿瘤、降血糖等作用[5]。小半夏汤整方除止呕外，还能抗炎[6]、治疗眩晕[2]等，但其药效物质及作用机制尚不清楚。

中药复方是通过多成分协同作用于不同器官的多种靶标，调节机体多种生物过程和功能，进而发挥整体治疗作用。网络药理学研究契合了这一复杂体系作用特点，为研究复方药效物质及作用机制提供了新思路与方法[7]。本研究利用网络药理学方法预测小半夏汤活性成分及靶点、分析其生物功能及信号通路，旨在探索该方药效物质及作用机制，为临床运用提供参考。

1 资料与方法

1.1 分析平台与软件 ① 中药分子机制生物信息学分析平台BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)；② 中药系统药理学分析平台数据库TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)；③ 蛋白质相互作用分析平台STRING(https://string-db.org/)；④ 人类基因组注释数据库DAVID6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)；⑤ 蛋白质数据库Uniprot(http://www.uniprot.org/)；⑥ 网络图形拓扑分析与编辑软件Cytoscape ⑦ Omicshare (http://www.omics-hare．com /tools /index.php/)平台；⑧ ClueGO基因分析软件。

1.2 小半夏汤活性成分、靶点筛选及其网状图 以口服生物利用度(OB)>30%，类药性(DL)>0.18作为条件，在TCMSP数据库中筛选小半夏汤中半夏与生姜的活性成分及其靶点；在“药物-靶点相似性”平台BATMAN -TCM中，以相似性模型阀值“Score cutoff=30”为条件筛选小半夏汤中半夏与生姜的活性成分及其靶点，将二者靶点合并后与活性成分导入Cytoscape软件，构建“小半夏汤活性成分-靶点”网状图。

1.3 蛋白互作网络构建 将小半夏汤靶蛋白导入STRING数据库，蛋白种类设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阀值设为中等“medium confidence”，其余参数均保持默认，构建小半夏汤靶蛋白之间的相互作用网络(protein-protein interaction network，PPI network)。将PPI网络以TSV格式导入Cytoscape进行可视化处理，并利用“Network Analysis”功能计算各靶点度值(Degree)与介数(Betweenness)，明确小半夏汤关键靶基因。

1.4 GO生物过程和KEGG通路富集 采用DAVID6.8数据库，以P-value<0.05筛选小半夏汤靶点富集的KEGG通路并归类，运用Omicshare可视化分析KEGG通路；利用Cytoscape软件中的“BINGO”插件对所有靶基因进行GO富集，再使用“ClueGO”插件对关键靶基因行GO富集，设置参数：定义来源为“Homo sapiens”(智人)，P值≤0.05，Interval Min Level=11，Max Level=13。

2 结果

2.1 小半夏汤活性成分、靶点及其网状图 在TCMSP数据库及BATMAN -TCM平台挖掘到小半夏汤12个活性成分，参考文献[8-9]再补充鸟苷、亚油酸、姜酮及β-水芹烯，共纳入16个活性成分进行研究(表1)。16个活性成分对应209个靶点，其网状图含有225个节点，288条边。7个菱形节点代表来源于生姜活性成分，9个八边形节点代表来源于半夏的活性成分，209个倒三角形节点代表活性成分对应的靶点(图1)。网络度值平均为18，介数平均为0.19，其中麻黄碱、β-谷甾醇、姜烯、姜醇、姜酮、缬氨酸6种化合物的度值与介数均超过均值，可能是小半夏汤的主要活性成分。

表1 小半夏汤活性成分

图1 栀子干姜汤活性成分-靶点网络图

2.2 靶点PPI网络分析 如图2所示，PPI网络有201个节点(8个靶点未参与互作)，1294条作用连线，平均度值为13，平均介数为0.008。SRC、MAPK1、FOS、JUN、CREB1、ESR1、BCL2、TNF、PIK3CG TH 等43个靶点的度值、介数均超过平均值，说明这些靶点在PPI网络中处于重要位置，可能是小半夏汤发挥药理作用的关键靶点。

图2 靶蛋白PPI网络

2.3 KEGG信号通路分析 表2是小半夏汤靶基因参与的7大类30条通路，包括6条癌症通路、4条代谢通路、4条炎症通路、6条神经系统通路、3条心血管系统通路、2条呼吸系统通路及5条信号转导通路。图3是所有通路的Omicshare点状图分析，由图可见P值最小的是神经活性配体-受体相互作用通路；富集因子最高的是酪氨酸代谢；而目标基因最多的是神经活性配体-受体相互作用通路和癌症通路。

表2 KEGG信号通路

续表2 表2 KEGG信号通路

图3 KEGG信号通路富集

2.4 GO富集分析 利用“BiNGO”插件对209个靶点进行GO生物过程富集，最终得到P值<0.05的GO条目1915个，3435个层级连线；再通过ClueGO对小半夏汤中43个关键靶点进行GO分析得出12大类生物过程(图4、图5)，其中4类富集于神经系统方面，如兴奋性突触后电位的正调节(14.29%)、前脑神经元发育(2.04%)、神经元投影再生(4.08%)、轴突再生(4.08%)，提示小半夏汤参与的体内生物过程广泛，尤其在神经系统方面更甚。

图4 GO功能注释饼状图

图5 GO功能注释网络

3 讨论

中药复方具有多成分、多靶点、多效应的作用特点，小半夏汤功效研究目前主要局限在止呕[10]、防眩晕[2]两方面，其他药理学作用及机制尚不清楚，临床应用范围狭窄。本研究筛选小半夏汤中16个活性成分及其209个靶点，并进行KEGG信号通路和GO生物过程富集，发现小半夏汤在炎症、癌症、神经以及心血管系统等多个方面都具有药理作用。

3.1 小半夏汤在心血管及神经系统疾病方面功效研究 从小半夏汤活性成分层面来看，其在心血管及神经系统疾病方面可能存在良好的治疗价值。李斌等[11]发现半夏中的麻黄碱、胆碱和鸟苷等生物碱具有抗心律失常的作用，β-谷甾醇以及棕榈酸、亚油酸等脂肪酸类可降低血脂。姜程曦等[12]发现生姜中的6-姜酚可兴奋心脏、扩张血管、促进血液循环，增加心肌细胞肌浆内质网摄取从而加强心肌收缩力。由PPI分析可知，其心血管药理作用与GPER、SCN5A、KCNH2、PIK3CG等基因密切相关。GPER是G蛋白耦联雌激素受体，参与调节血管内平衡、血管紧张度、血管系统受体的表达、血压及血管细胞生长[13]；SCN5A与心房功能有密切关系[14]；KCNH2则与长QT 综合征有关[15]；PIK3CG是影响冠心病发生的微效基因[16]，且上述基因主要富集在肾素分泌、心肌细胞肾上腺素能信号转导等心血管通路。GO及KEGG富集显示小半夏汤靶基因在轴突再生、中枢神经系统发育、神经元投影再生等多个神经生物过程显著富集，参与帕金森病、γ-氨基丁酸能突触、胆碱能突触、5羟色胺受体、多巴胺受体信号通路等。其中5羟色胺受体与多巴胺受体与呕吐的发生密切相关，它们的受体拮抗剂是临床常用的止呕药物，这也可能是小半夏汤止呕的中枢机理。另外，研究[17]发现半夏总生物碱不仅能改善帕金森病大鼠学习记忆功能；还能增加脑内γ-氨基丁酸含量及其受体mRNA的表达，抑制兴奋性神经递质的释放，使脑内抑制功能增强，具有抗癫痫作用[18]。半夏中的黄芩苷通过抑制TNF-α的表达，减轻炎症反应和修复损伤的血脑屏障，对大鼠缺血性脑损伤具有保护作用[19]。而生姜中的姜醇、姜烯和β-水芹烯等挥发油成分能显著改善缺血再灌注模型小鼠脑组织含水量[20]；姜黄素则通过增加FOS基因表达，抑制JUN基因表达，避免神经元的缺血/再灌注损伤[21]，从而发挥脑保护作用。

3.2 该复方在癌症和炎症两方面的作用及机制探讨 KEGG通路分析显示小半夏汤靶基因显著富集在癌症和炎症上，前者包括前列腺癌、结直肠癌、小细胞肺癌、p53信号通路等多条癌症通路，涉及PTEN、MAPK1、BCL2、ATF2、MAOA、TGFB1、WNT5A、CASP3和JUN等关键靶基因；后者参与了肿瘤坏死因子、炎性肠病、NF-kB等多条经典炎症通路。研究发现生姜中的6-姜酚能抑制VEGF诱导的上皮血管细胞增殖[22]；6-姜烯酚能通过激活BCL2的表达，诱导人结直肠癌细胞凋亡[23]。半夏中的黄芩苷、茴香脑、亚油酸、棕榈酸、β-谷甾醇、生物碱类都具有抗癌作用，如半夏生物碱对人肝癌细胞Bel-7402有明显的抑制作用[24]，β-谷甾醇可加速乳腺癌细胞凋亡[25]。炎症方面，半夏总生物碱对小鼠急性炎症有抑制作用，对大鼠棉球肉芽肿亚急性炎症也具有较强的抑制作用[26]；生姜中的姜醇、姜烯、β-水芹烯和姜辣素等能明显降低小鼠毛细血管通透性，抑制二甲苯所致的耳廓炎症，抑制肉芽组织增生[9]，这些研究都表明小半夏汤具有一定的抗癌、抗炎潜力。

此外，研究还发现小半夏汤能富集在糖尿病、百日咳等疾病，但未见相关临床报道，需进一步深入研究。综上所述，通过网络药理学分析，小半夏汤多成分-多靶点-多通路-多效应的药理学作用得以展示，为临床运用拓展奠定了一定的基础。但由于网络药理学研究主要关注于药物活性成分，对其在汤剂中的含量、活性成分间相互作用以及体内代谢过程等考虑不周，故研究结果尚存在一定的局限性。