玉米弯孢叶斑病菌多聚半乳糖醛酸酶Clpg1基因功能验证

崔佳 赵丰舟 刘震 曲建楠 刘铜 左豫虎

摘要 ：为明确玉米弯孢叶斑病菌的多聚半乳糖醛酸酶基因Clpg1在其致病过程中的作用，采用Double joint PCR技术构建融合片段，利用PEG介导的原生质体转化技术获得18株抗潮霉素突变体，经检测得到1株Clpg1基因敲除突变体ΔClpg1。通过与野生型菌株比较，发现ΔClpg1产孢量和孢子萌发率下降、多聚半乳糖醛酸酶活性降低，致病力减弱。这些结果表明Clpg1基因影响多聚半乳糖醛酸酶活性，调控了玉米弯孢叶斑病菌的致病性。

关键词 ：玉米弯孢叶斑病菌; Clpg1; 基因敲除; 生物学特性; 致病性

中图分类号：

S 432.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018485

Functional verification of polygalacturonase Clpg 1 gene in

Curvularia lunata causing maize Curvalaria leaf spot

CUI Jia1， ZHAO Fengzhou1， LIU Zhen2， QU Jiannan1， LIU Tong2， ZUO Yuhu1

（1. College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China;

2. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， China）

Abstract

In order to clarify the role of polygalacturonase Clpg1 gene in the pathogenicity of Curvularia lunata， the fusion fragment was constructed using double joint PCR， and 18 hygromycin resistant mutants were obtained by using PEG mediated protoplast transformation technique. A knock out mutant ΔClpg1 which contained no Clpg1 gene was found. Compared with the wild type strain， the sporulation yield and germination rate of ΔClpg1 decreased; the polygalacturonase activity was reduced， and the pathogenicity was weakened. These results indicate that the Clpg1 gene affects the polygalacturonase activity and regulates the pathogenicity of Curvularia lunata.

Key words

Curvularia lunata; Clpg1; gene knockout; biological characteristics; pathogenicity

由新月弯孢Curvularia lunata引起的玉米弯孢叶斑病是一种严重的叶部病害，在我国普遍发生，严重影响玉米产量，有时甚至超过玉米大斑病和黑粉病引起的损失[12]。研究发现，新月弯孢存在明显生理分化和致病性变异[34]。多聚半乳糖醛酸酶（PG）是降解植物果胶骨架结构的主要酶之一，是一類重要的果胶酶[58]。果胶酶在植物病原菌侵染寄主的过程中起重要作用，是病原菌致病因子之一[911]。Jia等通过对辣椒疫霉Phytophthora capsici的毒力和酶活性的试验表明，辣椒疫霉中的多聚半乳糖醛酸酶及果胶裂解酶等的酶活性在致病性中起主要作用，随着发病程度加重酶活性升高[12]。Shieh等[13]对黄曲霉Aspergillus flavus产生的内切多聚半乳糖醛酸酶P2 c进行了研究，发现P2 c有助于黄曲霉对棉铃的侵染和定殖，导致致病性加剧，表明PG参与黄曲霉的致病过程。Roper等[14]则发现糖基水解酶基因家族中pglA基因编码的PG是引起难养木质部小菌Xylella fastidiosa侵染葡萄Vitis vinifera必须的关键致病因子，该基因缺失后X.fastidiosa无法侵染寄主植物。Ten Have等[15]通过对灰葡萄孢Botrytis cinerea的内切半乳糖醛酸酶Bcpg1基因进行基因敲除，发现Bcpg1基因的缺失导致PG的酶含量降低，其致病力显著降低。值得注意的是，当紫麦角菌Claviceps purpurea的两个PG基因Cppg1和Cppg2被敲除后，病菌的致病力几乎丧失[16]。冯晶等[17]将玉米弯孢叶斑病菌分别接种到玉米抗感两个品种上，发现PG在玉米弯孢叶斑病菌侵染过程中可能起重要作用。周舒扬等[18]对玉米弯孢叶斑病菌进行酶活性的测定，发现病原菌可以产生多聚半乳糖醛酸酶等，PG分别在第4天和第10天产生一个峰值，酶活性变化较大，表明PG可能与其致病性相关。

本研究通过构建玉米弯孢叶斑病菌Clpg1基因敲除突变体，分析其对病原菌菌丝生长、分生孢子和附着胞的形态、产孢量和孢子萌发率、多聚半乳糖醛酸酶活性、致病性的影响，旨在明确Clpg1在病菌致病过程中的生物学功能，为进一步解析玉米弯孢叶斑病菌致病分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与材料

野生型玉米弯孢叶斑病菌DQ 1保存于黑龙江八一农垦大学植物病理与应用微生物研究所。玉米‘黄早四由沈阳农业大学薛春生教授惠赠，质粒pBHt1由上海交通大学陈捷教授惠赠。大肠杆菌感受态DH5α购自天根生化科技有限公司，pMD 19T Vector购自TaKaRa公司。

反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）和荧光定量试剂盒SYBRTM Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）以及Quick Taq酶均购于TaKaRa公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）、质粒大提试剂盒及全RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant Kit购于天根生化科技有限公司，TRIzol试剂购于Invitrogen公司，潮霉素B购于Roche公司，溶壁酶购于广东微生物所，PEG 4000购于MP公司。引物利用软件Primer 5 进行设计，由铂尚生物技术（上海）有限公司合成，本研究所用引物见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 果胶诱导下Clpg基因的表达分析

选取在PDA培养基上培养7 d的野生菌DQ1菌落，沿边缘打取5块直径为5 mm的菌饼，分别转接到含有0.2 g果胶的100 mL PD液体培养基中诱导DQ 1的Clpg基因的表达，28℃，120 r/min恒温振荡培养2、4、6和8 d后，在无菌环境下用无菌水冲洗，收集菌丝，置于-80℃保存备用。

总RNA的提取及第一链cDNA合成：参照说明书采用试剂盒提取总RNA，-80℃保存备用。选用第一链cDNA试剂盒进行反转录，反转录后的cDNA于-20℃保存备用。

荧光定量PCR：选用GADPH为内参基因，cDNA为模板，引物Clpg1 F/R、Clpg2 F/R、Clpg3 F/R和Clpg4 F/R分別扩增Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4基因，qRT PCR采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa，Japan）试剂盒以及ABI 7500系统（Applied Biosystems，美国）进行。反应体系步骤按说明书进行，相对表达量用2-ΔΔCt方法计算，试验重复3次。

1.2.2 Clpg1基因敲除载体构建

利用CTAB法提取野生菌DQ 1基因组，以DNA为模板，引物Clpg11 F/R扩增Clpg1基因的上游片段UP，引物Clpg12 F/R扩增Clpg1基因的下游片段DOWN，引物HPH F/R扩增hph基因片段，并将条带切胶回收，连接到pMD19 T simple Vector载体，挑选阳性菌落测序。使用Double joint PCR方法构建融合片段，方法参照宋娜等[19]略有修改。将上述UP、HPH、DOWN片段为模板，通过Double joint PCR法获得UP HPH DOWN重组片段。

Double joint PCR法分两步。第一步：将UP、HPH以及DOWN片段混合进行PCR扩增，反应条件为95℃ 2 min;95℃ 30 s，65℃ 4 min，72℃ 1.5 min，15个循环;72℃ 10 min;16℃保存。第二步：将第一步的PCR产物用引物Clpg11 F/Clpg12 R进行扩增，反应程序为95℃ 2 min;95℃ 30 s，65℃ 4 min，72℃ 1.5 min，35个循环;72℃ 10 min;16℃保存。

将所得上述片段切胶回收，连接到pMD19 T simple Vector载体，挑选阳性菌落测序。随后将融合片段UP HPH DOWN用于原生质体转化。原生质体制备与PEG介导原生质体转化方法参照刘铜等[20]。将原生质体涂布在含有200 μg/mL潮霉素的原生质体固体再生培养基平板上，28℃培养7 d，然后将新长出来的单个菌落转移到含潮霉素（200 μg/mL）的PDA平板上进行二次筛选，再将正常生长的菌落转移到PDA平板上，筛选第3次，如此交替到第5代可以正常生长的玉米弯孢叶斑病菌即为转化子。

1.2.3 Clpg1基因敲除突变体鉴定

在DNA水平上对突变体进行检测：以野生菌DQ 1和突变体的DNA为模板，利用引物HPH F/R和引物Clpg1 F/R分别检测野生菌与突变体中的hph基因和Clpg1基因。

在转录水平上对突变体进行检测：通过RT PCR技术在转录水平检测。以cDNA为模板，采用TaKaRa公司的反转录试剂盒Prime ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）进行反转录，以GAPDH为内参基因，引物Clpg F/R扩增目的基因，进行RT PCR检测。

1.2.4 生物学特性

菌落和孢子形态：将野生型DQ 1、敲除突变体ΔClpg1和带潮霉素基因的抗性转化子DQ ECT接种在PDA平板中央，28℃黑暗条件培养5 d后对菌落形态进行观察，拍照记录，同时分别制备孢子悬浮液，显微镜观察孢子形态照相记录，并对孢子形态进行统计（每个重复统计500个孢子）。设置水平重复，生物学重复各3次。

产孢能力和孢子萌发率测定：将DQ 1、DQ ECT和ΔClpg1菌株，在PDA平板上培养5、7 d后，选取6个直径为6 mm的菌饼放到10 mL离心管中，用ddH2O洗下孢子，对过滤得到的孢子悬浮液进行孢子产量统计。将培养7 d的菌株，制备浓度为106cfu/mL的孢子悬浮液，采用悬滴法进行孢子萌发率的统计，28℃倒置培养3、6、9 h，观察并记录结果。每个菌株至少观察3皿，试验重复3次[21]。

附着胞形态观察：将培养7 d的DQ 1、DQ ECT和ΔClpg1，分别制备成孢子悬浮液，调节浓度到一个视野中有1～2个孢子为宜。取洋葱内表皮（约1 cm×1 cm）置于载玻片上，在其表皮上滴加20 μL孢子悬浮液，28℃保湿培养7.5 h，显微镜下观察附着胞的形态并拍照。设置3次水平重复和3次生物学重复[21]。

1.2.5 ΔClpg1敲除突变体PG酶活测定

将菌株DQ 1、DQ ECT和ΔClpg1在PDA培养基上培养5 d，分别向每100 mL培养液中加入5块直径为6 mm菌饼，28℃振荡培养3 d。收集滤液，10 000 r/min冷冻离心30 min，得到的上清液即为待测酶液[22]。通过DNS法在分光光度计540 nm处测定待测液的吸光值，根据酶反应释放的还原糖计算多聚半乳糖醛酸酶活性。

测定方法：取底物0.5 mL加1 mL 0.05 mol/L pH=5.0醋酸 醋酸钠缓冲液和1%多聚半乳糖醛酸溶液。50℃水浴锅中酶解60 min后，加3 mL DNS终止反应，振荡混匀，在540 nm处测定其酶活。对照在终止反应加入底物，操作同上，结果用U/mL表示。

1.2.6 致病性检测

取相同叶龄玉米叶片的相同部位，叶片两端用浸湿6 BA溶液（10 mol/L）的棉花包裹。致病性检测包括离体叶片的伤口处理及无伤口处理。检测方法参照马炳辰[21]，将培养7 d的DQ 1、DQ ECT和ΔClpg1菌株的PDA菌饼（直径为6 mm）或滴加10 μL浓度为107cfu/mL孢子悬浮液（孢子悬浮液中加入0.02% Tween 20和2%的蔗糖）分别接种在玉米叶片正面，28℃昼夜交替光照保湿培养。每天观察记录发病情况，设3次水平重复和3次生物学重复[21]。

1.3 数据分析

所有数据均使用SPSS软件进行差异显著性分析（P=0.05），结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 果胶诱导下PG基因家族表达分析

玉米弯孢叶斑病菌Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4基因在果胶诱导的不同培养时间均有表达。Clpg1和Clpg2在果胶诱导培养6 d时表达量最高，Clpg3和Clpg4在4 d时表达量最高，其中Clpg1基因表达量最高（图1）。前期研究也表明Clpg1基因在病菌与寄主互作3 h后表达量最高[23]。这些结果表明Clpg1基因在病菌侵染早期可能起重要作用。

2.2 Clpg1基因敲除

以野生型 DQ 1的DNA扩增Clpg1基因的上下游片段，分别得到853 bp UP片段、634 bp DOWN片段，经测序片段与目的序列一致（图2a）。以pBHt1质粒为模板扩增潮霉素片段，得到1 343 bp的HPH片段，经测序片段与目的序列一致（图2b）。回收产物通过Double joint PCR法，构建出一条片段长为2 830 bp的融合片段UP HPH DOWN（图2c）。

经原生质体转化和再生培养基筛选，共获得19株潮霉素抗性菌株;将这19株菌株放在含有潮霉素B和不含潮霉素B的PDA培养基上交替培养5代后，最终获得18株抗潮霉素的转化子（图3）。

经检测，18株抗潮霉素的转化子中鉴定出1株不含Clpg1基因的转化子（图4a和图4b）。通过RT PCR对Clpg1基因表达量的分析，发现该突变体中Clpg1基因不表达，表明该转化子为Clpg1敲除突变体，命名为ΔClpg1（圖4c）。

2.3 生物学特性观察

对野生型菌株DQ 1、带潮霉素的抗性转化子DQ ECT和敲除突变体ΔClpg1的生物学特性进行观察。ΔClpg1敲除突变菌株在PDA培养基上的菌落形态与DQ 1存在较小差异。所有菌株菌落均为墨绿色，但ΔClpg1没有同心圆环，菌丝较野生型菌株DQ 1更致密且平滑，分生孢子形态无差异，附着孢的形成正常（图5）。通过对产孢量和孢子萌发率检测发现ΔClpg1比野生型DQ 1的产孢量和孢子萌发率均显著降低（P<0.05）（图6）。

2.4 ΔClpg1多聚半乳糖醛酸酶活性

通过多聚半乳糖醛酸酶活性测定，结果表明DQ 1、DQ ECT和ΔClpg1的PG酶活性分别为（780±0.11）U/mL，（8.02±0.03）U/mL和（6.49±0.21）U/mL。其中ΔClpg1多聚半乳糖醛酸酶的酶活性比野生型菌株DQ 1下调了16%，显示ΔClpg1敲除突变体的PG酶活性下降，Clpg1基因的缺失影响了多聚半乳糖醛酸酶的活性。

2.5 致病性检测

通过对DQ 1、DQ ECT和ΔClpg1离体叶片有伤口和无伤口接种处理，发现孢子悬浮液和菌饼接种后ΔClpg1的病斑面积都明显小于DQ 1的病斑面积（图7），ΔClpg1敲除突变体对寄主植物的致病性减弱，表明基因Clpg1可能参与了病菌致病性调控。

3 讨论

目前，病原菌的细胞壁水解酶参与致病已有许多报道。病原菌产生一系列细胞壁水解酶降解植物细胞壁，破坏寄主组织细胞，释放营养物质，促进病原菌繁殖，有利于病害的发生。细胞壁水解酶主要包括果胶酶、角质酶和纤维素酶等，根据作用底物的不同，果胶酶又分为多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲酯水解酶和果胶裂解酶等[24]。多聚半乳糖醛酸酶是一种细胞壁水解酶，在细菌、真菌和植物中普遍存在，是细菌和真菌降解寄主植物细胞壁的主要酶之一[2526]。Williamson等[27]首次通过分离纯化树莓果实获得了PGIP蛋白，并且发现可以对灰霉菌的PG酶活性产生抑制作用。2005年巩振辉等[28]克隆了樟疫霉菌Phytophthora cinnamomi多聚半乳糖醛酸酶Pcpg16和Pcpg17基因。本研究通过荧光定量PCR技术发现玉米弯孢叶斑病菌Clpg基因家族成员在果胶诱导下的不同时期基因均有表达，且Clpg1基因表达量最高，推测Clpg1在诱发玉米弯孢叶斑病中起重要作用。2009年Sun等[29]克隆了辣椒疫霉的7个PG基因，采用荧光定量PCR对叶片内Pcipg2基因进行检测，发现在接种后的第7天 Pcipg2表达量最高，并对Pcipg2基因进行原核表达后接种辣椒健康植株叶片出现病斑，表明其参与了病原菌的致病过程。本研究利用Double joint PCR法构建了Clpg1基因的敲除突变体，通过对表型、DNA水平以及转录水平分析，获得了一个Clpg1基因敲除突变体，通过对突变体的致病力分析，结果表明ΔClpg1突变体对玉米的致病性有所减弱，暗示Clpg1基因可能参与了病菌的致病过程。Valette Collet等[30]研究表明灰葡萄孢的其中一个多聚半乳糖醛酸酶基因的缺失，导致发病延迟且致病性降低50%～85%。这与本论文Clpg1基因敲除后致病力减弱的研究结果一致，表明Clpg1基因参与玉米弯孢叶斑病菌的致病性。然而病原菌在侵染过程中可以产生不同PG酶，并且不同的PG同工酶在致病性中作用存在差异。本研究鉴定的4个基因中，目前只对Clpg1基因进行敲除并且对其功能进行验证，但是其他3种同工酶是否参与功能调控以及致病性，还有待进一步的研究，该研究结果也为后期的试验奠定基础。

4 结论

玉米弯孢叶斑病菌PG基因家族成员Clpg1基因在果胶酶诱导下，6 d时表达量最高，敲除突变体ΔClpg1在菌丝生长、产孢量、孢子萌发率等特性上均与野生型DQ 1存在差异。与野生型菌株比较，多聚半乳糖醛酸酶活性降低，ΔClpg1致病性减弱，因此推测该基因参与了病原菌的致病性调控。

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（责任编辑：田 喆）