短期超量补充维生素E对热应激生长猪呼吸性碱中毒和氧化应激的改善作用

2019-02-10吴美芹孟令凯

中国饲料 2019年24期

吴美芹，孟令凯

（招远市农业农村局，山东招远 265400）

热应激除了降低采食量外，还可直接危害猪的健康状况，其中热应激引起的两种主要疾病是氧化应激和呼吸性碱中毒，这两种疾病均对猪的健康造成全面危害（李静等，2005）。在热应激条件下，猪将血液重新分配到周围组织，并增加呼吸频率，以最大限度地散热。因此，随着体温的升高，内脏组织血流量减少，引发猪肠道和骨骼肌氧化应激。氧化应激是自由基和抗氧化能力失衡的结果，它破坏脂质、蛋白质和核苷酸，从而扩大对细胞和器官的功能的影响，特别是氧化蛋白的增加与家畜各种代谢紊乱有关（黄帆和吕秋凤，2017）。另一方面，过度呼吸会降低血液中的二氧化碳含量，从而引发碱中毒，呼吸性碱中毒可干扰机体各种生化和生理过程，如降低钙离子浓度，增加乳酸生成（赵久成和公海涛，2016）。因此，减轻猪氧化应激和呼吸性碱中毒对维持猪的健康和生产至关重要，营养剂补充可能为缓解猪氧化应激和呼吸性碱中毒提供一种灵活、经济的策略。

维生素E是一种脂溶性抗氧化剂，能中和自由基，NRC（2012）建议正常饲养条件下的猪日粮中维生素E含量应达到11 IU/kg。但目前还不清楚猪是否需要更多维生素E来对抗氧化应激。Chauhan等（2014）研究发现，日粮超剂量补充抗氧化物质（100 IU/kg 维生素E+1.2 mg/kg硒）不仅可以减轻氧化应激，还有效改善热应激条件下羊的呼吸频率和呼吸性碱中毒，表明短期超量补充抗氧化剂可以有效维持机体酸碱平衡，减轻热应激介导的氧化应激。因此，本研究旨在探讨日粮短期超剂量添加维生素E对热应激条件下猪氧化还原状态的影响，确定维生素E在改善呼吸性碱中毒中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物与日粮设计试验采用2×2因子设计，包括两种日粮处理和两种温度条件。将48头平均体重为（24±2）kg的生长猪随机分为2组，每组4个重复，每个重复6头猪。对照组饲喂基础日粮（维生素E水平为17.5 IU/kg），处理组在基础日粮中额外补充维生素E，使维生素E水平达到205 IU/kg。猪只饲喂14 d后，将对照组和处理猪分别置于温度为20℃、相对湿度45%的条件和温度为35.5℃、相对湿度为35%～45%的条件下饲养7 d。对照组日粮组成及营养水平见表1。试验期间，猪只被单独饲养在带有金属网地板的板条箱中。为尽量减少两个不同温度组采食量的差异，将采食量限制在20℃条件下猪只自由采食量的75%左右。

表1 日粮原料组成及营养水平

1.2 生理状况监测在7 d热应激期间，每天分别于9点、13点和16点监测猪的呼吸频率和测定直肠温度3次。直肠温度用电子体温计测量，用秒表在20 s内测定呼吸频率。

1.3 血液采集及气体分压测定分别在热应激第7天的9点和15点从颈静脉采集血样2次，血液样品用于测量二氧化碳分压、氧气分压、碳酸氢盐浓度和pH。血液样本分装在肝素钠和EDTA包被的采血管中，采集0.5 mL白细胞，加入1 ml RNAlater溶液，4℃保存过夜后于-20℃保存。肝素化的血浆样本保存在-80℃，直到进一步分析氧化应激生物标志物。

1.4 基因表达分析试验分析了热休克蛋白70基因（HSP70）和缺氧诱导因子1α基因（HIF-1α）的表达丰度。引物设计和PCR操作参考Liu等（2018）的方法。

1.5 统计分析数据分析采用SPSS通用线性模型，以重复为试验单元。直肠温度和呼吸频率试验数据以温度×日粮×时间的平均值和标准差表示。血液变量的结果汇总并以温度×日粮的均值和标准误差表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.10为有显著差异趋势。

2 结果与分析

2.1 采食量和生理状况试验期间通过限制日采食量保证对照组与处理组平均日采食量为（1.46±0.002）kg，平均日采食量不受温度和日粮处理影响（P＞0.05，数据未列出）。由图1可知，热应激使直肠温度显著升高（20℃和35℃组分别为38.3℃和39.6℃，P＜0.05）。温度和时间对直肠温度的影响具有显著交互作用（P＜0.05），直肠温度从9点的38.6℃升高到13点的39.9℃，之后在16点维持在40.1℃。日粮处理对直肠温度无显著影响（P＞0.05），同时日粮、温度和时间对直肠温度的影响无显著交互作用（P＞0.05）。

图1 日粮和温度对生长猪直肠温度的影响

由图2可知，热应激显著提高了生长猪呼吸频率（20℃和35℃为31～124次/min，P＜0.05），温度与时间之间存在显著交互作用（P＜0.05），在9～13点呼吸速率由51次/min增加到154次/min，在16点趋于平稳为166次/min，而在20℃时，全天的呼吸频率维持不变（P＞0.05）。日粮处理对呼吸频率无显著影响（P＞0.05），同时日粮、温度和时间对呼吸频率的影响无显著的交互作用（P＞0.05）。

图2 日粮和温度对生长猪呼吸频率的影响

2.2 血液气体变量由表2可知，血中二氧化碳分压由58.7 mmHg显著下降至46.8 mmHg（P＜0.05），碳酸氢盐由37.0下降至33.1 mmHg（P＜ 0.05），pH由 7.42上升至 7.46（P ＜ 0.05）。温度对血氧气分压无显著影响（P＜0.05）。日粮维生素E水平对二氧化碳、氧气分压、pH和碳酸氢盐无显著影响（P＞0.05），但温度和日粮对血液气体分压、碳酸氢盐和pH的影响具有显著交互作用（P＜0.05）。在20℃条件下，对照组与处理组对血液气体分压、碳酸氢盐和pH的影响无显著差异（P＞0.05），但在35℃条件下，与对照组相比，处理组二氧化碳分压、碳酸氢盐含量显著提高（P＜0.05），血液pH显著降低（P＜0.05）。

2.3 血液氧化应激指标和相关基因表达由图3和图4可知，热应激显著增加HSP70基因mRNA丰度（P＜0.05），有提高HIF-1α基因mRNA丰度的趋势（P=0.08）。

图3 日粮和温度对生长猪HSP70基因mRNA丰度的影响

图4 日粮和温度对生长猪HIF-1α基因mRNA丰度的影响

由表3可知，温度和日粮处理对活性氧浓度均无显著影响（P＞0.05），但温度和日粮对血浆活性氧浓度的影响具有显著交互作用（P＜0.05）。热应激使血浆生物抗氧化物含量2.97 mM显著降低至2.74 mM（P＜0.05），但日粮处理对该指标无显著影响（P＞0.05）。热应激有提高氧化蛋白产物的趋势（P=0.07），从16.4 μM升高至26.9 μM，但日粮处理对该指标无显著影响（P＞0.05）。温度和日粮处理对血浆硫醇基水平均无显著影响（P＞0.05）。

表2 日粮和温度对生长猪血液气体变量的影响

表3 日粮和温度对生长猪血液氧化应激指标的影响

3 讨论

本研究的假设是短期过量补充维生素E（200 IU/kg）可以减轻热应激对猪的生理反应、呼吸性碱中毒和氧化应激的影响。研究数据表明，本研究使用的维生素E补充剂并没有减轻猪的氧化应激，但缓解了热应激诱导的呼吸性碱中毒。热应激使直肠温度升高了1.3℃，呼吸速率提高3倍，有利于猪散热。同时，热应激使猪呼吸率增加，导致血二氧化碳分压下降20%，从而降低碳酸氢盐浓度。尽管如此，正常的血液pH却无法维持，因为血液pH从7.42增加到7.46，整个过程为典型的呼吸性碱中毒，不能用代谢性酸中毒来补偿。Chauhan等（2015）发现，热应激期间日粮补充抗氧化剂可以使血血液二氧化碳分压降低50%，阻止血液pH升高，避免血碳酸氢盐浓度降低，这与本研究结果一致。虽然目前还不清楚高剂量维生素E改善血液中二氧化碳分压损失的机制，但其效果与改善热应激绵羊呼吸频率无关，因为本研究中高剂量维生素E组并没有降低热应激猪的呼吸频率。换句话说，日粮补充维生素E可能对维持血液中二氧化碳浓度有直接作用，从而缓解热应激引起的呼吸性碱中毒。

血浆中氧化蛋白产物水平的提高可以说明热应激引起氧化应激。氧化应激的增加可能是由于抗氧化防御系统受损，因为在热应激期间生物抗氧化物降低9%。氧化应激的增加与热应激猪体温升高有关，可以通过白细胞中HSP70 基因mRNA丰度增加证明。但与热应激水平相似的绵羊不同（Chauhan等，2014），本研究结果的血浆活性氧浓度不受热应激条件的影响，这表明生物抗氧化物的降低不是由自由基增加引起的，但还应考虑影响抗氧化稳定性的其他因素。饲粮中添加维生素E并不能减轻热应激组猪的氧化应激，因为无论是生物抗氧化物的降低还是氧化蛋白产物的增加都不能通过添加维生素E得到缓解。本研究补充维生素E的总时间为3周，包括前2周和热应激1周。Kim等（2015）认为，连续3周补充维生素E足以增强组织维生素E的储备，补充维生素E（300 IU/kg）2周后，猪血浆和肌肉维生素E浓度达到最大浓度的80%。

本试验在20℃条件下，补充维生素E的日粮使猪血液中活性氧浓度降低20%，这表明日粮高剂量维生素E在中和正常生理状态下的自由基方面优于NRC（2012）推荐水平。但在热应激条件后，高剂量维生素E组和对照组血浆中活性氧浓度的差异减小，但具体机制尚不清楚。我们推测，维生素E、维生素C、谷胱甘肽等抗氧化剂缺乏协同作用，可能限制了维生素E对热应激猪氧化应激的缓解作用，因为维生素E的重建需要维生素C和谷胱甘肽过氧化物酶的参与（Rooke等，2004）。同样，在高温条件下添加125 mg/kg维生素E和0.5 mg/kg硒的肉鸡比单独添加维生素E或硒的肉鸡血浆丙二醛浓度降低（Ghazi等，2012）。因此作者认为，下一步应该研究日粮抗氧化物质的组合对热应激介导的氧化应激的改善作用。