耐药性与敏感性阿萨希毛孢子菌感染小鼠病死率的对比研究

彭卓颖，田艳丽，廖 勇，郎德休，敖俊红，杨蓉娅

阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）是一种致病性较强的条件病原真菌，可广泛存在于自然界中，也可定植于人体特定组织（皮肤和黏膜）[1,2]，其所致的播散性毛孢子菌感染的病死率可高达80%以上[3]。T.asahii对大部分常用抗真菌药物敏感性不高或耐药，仅对三唑类抗真菌药敏感[4]。但是，近年来逐渐出现该菌对唑类药物耐药的报道[5,6]，因此，T.asahii唑类抗真菌药耐药方面的研究逐渐受到人们的关注。既往研究发现，T.asahii环境株与临床株在致病性上存在一定差异[7]，但是并没有耐药株与敏感株在致病性方面的比较研究。本研究使用氟康唑对环境和临床敏感株进行体外梯度浓度诱导耐药，将所得的耐药菌株及其亲本菌株通过尾静脉注射到小鼠体内，最后观察感染不同菌株小鼠病死率的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株T.asahii环境株CBS8904、临床标准株CBS2479 和近平滑念珠菌ATCC22019（药敏质控株）均购自荷兰the Westerdijk Fungal Biodiversity Institute。

1.1.2 实验动物 BALB/c雄性SPF级小鼠85只，体重18～20 g，购自军事医学科学院动物研究中心。

1.1.3 主要试剂 蛋白胨、酵母粉（英国OXOID公司），葡萄糖（北京化学试剂有限公司），琼脂（北京经科宏达生物技术有限公司），两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑（美国Sigma），卡泊芬净（Cardinal Health），1640 干粉（sigma RB83），MOPS 干粉（amresco 0670）。

1.2 方法

1.2.1 耐药菌株的梯度浓度诱导 将-80℃保存的菌株进行复苏并传代，当真菌状态较好时（对数生长期），调整细胞浓度为5×106CFU/ml。取0.1ml 菌悬液接种到5 ml 含氟康唑[药物浓度1/2 最低抑菌浓度(MIC)值]的酵母膏胨葡萄糖（YPD）培养液中，35℃、150 r/min 震荡培养，24 h 后离心富集细胞，接种于高浓度氟康唑YPD 中培养，药物浓度由1/2 MIC 增加为MIC、MIC2……，直至YPD 培养液中MIC 为128 mg/L 时，菌株仍可生长，并进行体外药敏实验检测，如果菌株对氟康唑MIC 值＞64 μg/ml，此时判定敏感株被诱导为耐药株[8]。

1.2.2 耐药子代稳定性测试 耐药子代在无药SDA培养基上进行连续传代，每3 代检测其MIC 值，重复检测3 次[8]。

1.2.3 小鼠感染模型的构建 将标准株CBS8904、CBS2479 和氟康唑体外诱导的稳定耐药株8904R、2479R 制成浓度为3.2×107CFU/ml 的菌悬液，小鼠进行随机分组，实验组每组20 只，每只小鼠尾静脉注射0.3 ml 不同菌液；对照组5 只，每只小鼠尾静脉注射0.3 ml 生理盐水。记录1 个月内小鼠的存活情况，并对所有死亡小鼠进行解剖，获取脑、心、肝、脾、肺、肾等组织进行组织病理检查。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 5 软件作图并进行统计学分析，结果以均数±标准差表示，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株诱导耐药的结果

2.1.1 药敏结果 氟康唑诱导耐药菌株在无沙堡药培养基（SDA）上传代多次，随后进行药敏检测，结果如表1 所示，与亲代敏感株相比，耐药株8904R 和2479R 对氟康唑的MIC 值明显升高，对伊曲康唑和伏立康唑的MIC 值也有小幅度上升，而对两性霉素B、氟胞嘧啶和卡泊芬净的耐药性基本未发生变化。其中，诱导所得环境耐药菌株8904R 对氟康唑的MIC 值由0.25 μg/ml 上升为＞64 μg/ml，升高了256 倍以上；临床耐药株2479R 的MIC 值由0.5 μg/ml 上升为＞64 μg/ml，升高了128 倍以上。

表1 亲代、诱导耐药菌株体外药敏的MIC值（μg/mL）

2.1.2 氟康唑诱导前后菌株的形态学改变 临床敏感株CBS2479 表面颗粒状凸起，呈放射状分布，中间略厚；氟康唑诱导的耐药株2479R 由菌丝相向酵母相转化，表面光滑，边缘可见少量放射状菌丝分布。环境敏感株CBS8904 菌落与诱导所得8904R 均呈菌丝相，前者菌落呈放射状分布，表面呈颗粒状凸起，边缘较整齐，菌落厚度均一；后者菌落表面呈粉末状，中间部位凸出明显，边缘较薄（图1）。

2.2 T.asahii小鼠感染模型的构建

2.2.1 感染小鼠组织形态学改变 将死亡小鼠进行解剖，获取脑、心、肝、脾、肺、肾组织，观察各组织形态学变化。对照组小鼠各脏器表面光滑，均无充血现象；分别感染CBS8904、CBS2479、8904R 和2479R 的实验组小鼠的组织形态学变化较一致，肝脏和肾脏的体积均明显增大并出现水肿，组织表面可见散在点状出血，其中肝脏表面可见大量针尖至粟粒大小脓性结节（图2），脑、心、脾、肺等组织形态与对照组相同，未见明显差异。

2.2.2 感染小鼠组织病理学变化 在感染小鼠的组织中，肝脏和肾脏的形态学变化最明显，因此对各实验组小鼠的肝脏和肾脏进行组织病理学HE 染色及亮绿染色。观察染色结果发现，在感染CBS8904、CBS2479、8904R 和2479R 的实验组小鼠的肝脏和肾脏内均发现大量孢子（图3），但各实验组肝脏和肾脏内孢子的数量及分布并未发现明显差异。

图1 T.asahii 诱导前后菌株的形态学差异

2.3 小鼠被不同菌株感染后死亡情况

分别将环境敏感株CBS8904、环境耐药株8904R、临床敏感株CBS2479 和临床耐药株2479R 菌悬液通过尾静脉注射到小鼠体内；对照组注射等量生理盐水。通过对小鼠存活数量的统计计算出CBS8904 组与8904R 组小鼠生存率分别为45% 和55%，CBS2479 组 与2479R组生存率分别为20%和60%。从图4 中可以看出，感染环境敏感株与环境耐药株导致的小鼠死亡率之间无显著差异（P＞0.05），而感染临床敏感株小鼠的死亡率明显高于临床耐药株感染小鼠（P＜0.05）。

3 讨论

获取稳定的耐药菌株对于真菌耐药机制的研究十分重要，毛孢子菌病发病率较低，临床耐药株较难获取，与用物理或化学方法诱导的基因突变所导致的耐药相比，体外梯度诱导耐药的方法所得的耐药株及敏感亲本株更接近临床耐药株产生的过程[9,10]。笔者选取环境敏感株CBS8904 和临床敏感株CBS2479，采用MIC 值梯度浓度升高的方法用氟康唑对2 株菌进行体外诱导耐药并检测菌株药物敏感性，将诱导后的菌株在无药的SDA 培养基上进行多次传代，然后对其耐药表型的稳定性进行检测。CBS8904 菌株经体外诱导耐药后对氟康唑的MIC 值与诱导前相比升高了256 倍以上，而且诱导后的CBS2479 对氟康唑的MIC值也升高了128 倍以上，成功获得稳定的环境耐药株8904R 和临床耐药株2479R。2 株菌诱导后对其他唑类抗真菌药MIC 值轻度上升，未表现出明显的交叉耐药。

唑类药物的耐药机制主要有3 种[11]：第1 种是耐药真菌细胞膜上负责药物外排转运蛋白质的过度表达，其中包括ABC 超家族和异化扩散载体超家族；第2 种是真菌生物膜的形成，这种情况会使真菌对多种唑类药物产生耐药，因此是交叉耐药的主要机制；第3 种是唑类药物的靶酶羊毛甾醇14-α-去甲基化酶的变异，此酶是由ERG11基因所编码，有研究发现ERG11基因上的R467K 突变可降低靶酶对氟康唑的亲和力，从而导致耐药的产生[12]。本实验中氟康唑诱导出的耐药菌株并未对伏立康唑和伊曲康唑产生交叉耐药，推测其耐药机制应该属于第3 种情况，但是本推测有待进一步实验进行验证。

图2 对照组与感染组小鼠肝脏与肾脏的形态学改变

图3 感染小鼠内脏组织病理

图4 不同菌株感染组小鼠生存曲线图

环境敏感株CBS8904 被氟康唑诱导为8904R 后的形态并未发生明显变化，均为菌丝相；而由氟康唑诱导后的临床株CBS2479 则由表面粗糙、呈放射状分布的菌丝相变为表面光滑的酵母相。随后将所得耐药菌株及其亲本菌株通过尾静脉注射到小鼠体内，观察小鼠死亡情况。实验结果显示，CBS8904 和8904R 对小鼠的病死率无明显差异，而2479R 对小鼠的病死率却明显低于CBS2479。由以上结果可知，在微进化作用下CBS2479 菌株的形态发生改变，而且致病性减弱；但环境株CBS8904 的形态与致病性却未发生明显变化。有研究表明，生物膜的形成与菌株的毒力、耐药性以及宿主免疫逃逸机制等方面均有密切联系，而菌丝和关节孢子是构成生物膜的主要结构[13-15]。据此可以推断，2479R 菌株菌丝形成减少，其生物膜的构建能力被削弱，可能是使菌株毒力下降的主要原因。但是，菌株耐药引起的毒力变化呈多样性[16]，耐药性与致病性之间关系复杂，本实验结果为单一菌株的初步结果，需要增加环境来源以及临床来源的菌株做进一步研究和证实，机制有待更深入的研究。

综上所述，体外诱导出的环境耐药株8904R 和临床耐药株2479R 与其亲本在形态上均有明显差异，其中2479R 菌株转变为酵母相；在致病性方面，环境敏感株与氟康唑诱导出的环境耐药株之间无明显差异，而诱导出的临床耐药株的毒力明显低于敏感株，这可能与菌株的形态变化有关。虽然本实验中临床T.asahii耐药菌株的毒力降低，但是随着耐药菌株的进化，毒力较强的菌株仍有可能会出现，因此规范临床用药，避免耐药菌株的产生仍然非常重要；而且本实验结果为进一步研究T.asahii对唑类药物耐药的机制以及其形态学与毒力之间的关联奠定了良好基础，并为临床的相关研究提供了有利的依据。