KLF8及Snail1在结肠癌中的表达及意义

马 丽 贾喜花

河北省保定市第一中心医院 071000

结肠癌是较常见的恶性肿瘤。和欧美等国家相比，我国结肠癌患者的发病年龄逐渐升高，中位年龄在45岁左右。结肠癌在我国近30年的死亡率明显升高[1]。因此积极探索相关因子在结肠癌发生发展过程中的表达、找到其对应的治疗靶点对于结肠癌诊治具有重要意义。

有研究表明：上皮—间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)的主要特征是使上皮细胞丧失其极性同时并获得间质特性，从而使良性肿瘤获得发展为恶性肿瘤，甚至可获得侵袭转移至其他组织的能力[2-5]。已有研究证实KLF8通过下调E-cadherin的表达，诱导上皮间质转化(EMT)的发生，并进一步促进肿瘤细胞形成远处转移[6]。有研究表明，Snail1可通过下调E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，参与EMT的发生，使癌细胞的细胞表型发生改变，降低细胞间黏附，进而使其侵袭、转移能力增强，并诱导破坏细胞基底膜屏障[7]。另有研究发现，KLF8和Snail可能发挥并行和/或相互补充的调节EMT的角色[8]。本研究旨在观察KLF8及Snail1在结肠癌中的表达情况及二者的相关性，探讨二者在结肠癌发生、发展过程中的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本收集 选取我院2015年11月—2017年11月通过外科手术切除并经病理科医师证实的原发性结肠腺癌标本共计70例，选取的患者均有完整的临床病理资料，且同时保证这些患者术前均未行放疗、化疗及免疫、靶向治疗等在内的其他辅助治疗手段。其中男38例，女32例；年龄28～86岁，中位年龄59岁，其中≥59岁33例，<59岁37例；病理学分级：高分化癌24例，中分化癌28例，低分化癌18例；浸润深度：T1、T2 38例，T3、T4 32例；按2010年美国联合癌症分类委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)修订的TNM病理分期：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期35例。另选同期30例癌旁正常大肠组织标本(距肿瘤边缘>5cm)作为对照。

1.2 试剂 兔抗人KLF8抗体(购自博奥森公司)，兔抗人Snail1抗体(购自博奥森公司)；通用免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂(购自博奥森公司)。

1.3 免疫组化染色及结果判定 应用免疫组织化学染色二步法，KLF8(1∶100)阳性主要表达于细胞胞浆，呈棕黄色颗粒；Snail1(1∶100)阳性表达于细胞胞浆，呈棕黄色颗粒。切片在双盲情况下由2名病理科医师观察并最终进行结果评价。(1)每例每个指标随机观察5个高倍视野(×400)，计数阳性细胞数占细胞总数的百分比：阳性细胞率为0时，记为0分；阳性细胞率<10%时，记为1分；阳性细胞率为20%～50%时，记为2分；阳性细胞率>50%时，记为3分。(2)染色强度：染色为无色时，记为0分；染色为淡黄色时，记为1分；染色为棕黄色时，记为2分；染色为棕褐色时，记为3分。根据(1)×(2)计算并判定最终结果：最终得分0～2分记为阴性(-)，最终得分3～9分记为阳性(+)。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KLF8、Snail1的表达情况 结肠癌组织KLF8及Snail1的阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。见表1。

表1 KLF8及Snail1的阳性表达率

2.2 KLF8、Snail1表达与结肠癌临床病理特征的关系 结肠癌组织KLF8、Snail1表达与患者的性别、年龄及肿瘤的大小、分化程度无关(P>0.05)；而与患者的TNM分期、肿瘤的浸润深度及有无淋巴结转移有关(P<0.05)：KLF8及Snail1在TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、浸润深度为T3、T4的表达较TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期和浸润深度为T1、T2表达明显升高。见表2。

表2 KLF8、Snail1表达与结肠癌临床病理特征的关系

2.3 结肠癌组织KLF8、Snail1表达的相关性 结肠癌组织KLF8、Snail1表达不存在相关性。见表3。

表3 结肠癌组织KLF8、Snail1表达的相关性

3 讨论

细胞分为上皮细胞和间质细胞两种类型，它们在形态和功能上有明显的区别。 上皮间质转化(EMT)就是指上皮细胞表型在某些特定的条件下转化为间质细胞表型的过程。上皮细胞之间因有细胞极性的存在而使细胞之间有联系。间质细胞虽与上皮细胞相邻，但不同的是间质细胞之间不存在极性，故细胞之间缺乏联系，使细胞间和细胞与基底膜之间的黏附作用减弱，导致细胞浸润性和游走迁移的能力增强，变成具备间质细胞形态和特性的细胞[9]。广泛地说，EMT分为三种类型，Ⅰ型参与胚胎发育，Ⅱ型参与伤口愈合，Ⅲ型参与肿瘤的发生以及侵袭转移[10]。Ⅲ型EMT的发生使细胞间和细胞与基底膜之间的黏附作用减弱，细胞获得了浸润性和游走迁移能力。研究表明，EMT通过降低肿瘤细胞上皮标志基因的表达、增加间质标志基因的表达，使得肿瘤细胞之间的黏附作用削弱，肿瘤细胞更加容易发生迁移，从而从非侵袭状态转变为侵袭状态[11]。EMT是肿瘤细胞通过某种途径，作用于E-钙黏蛋白(E-cadherin)，下调E-cadherin的表达，降低由E-cadherin介导的细胞间的黏附，导致肿瘤细胞之间的极性和黏附能力丧失，进而增加肿瘤细胞的运动和侵袭性。因此通过某种途径抑制E-cadherin的表达，是癌症细胞得以浸润和转移的关键因素[12-13]。EMT的发生与E-cadherin密切相关，在肿瘤转移中起关键作用。

Krtippel样转录因子(Krtippel-like factors，KLFs)是一类具有锌指结构的基本转录因子，它能够结合DNA中的GC盒或相关的CACCC元件，通过调控富含GC启动子的基因表达，广泛参与细胞的多种生理病理过程[14-15]。该家族各因子的羧基端含有高度保守的DNA锌指结构域，而氨基端则与其功能密切相关。KLF8是KLFs家族中的一员。KLF8在羧基端有3个保守的C2H2锌指结构域，用于与DNA结合。锌指结构域是DNA结合的结构域，参与基因序列中CACCC原件的识别及结合，并通过一定的作用来发挥转录调控的功能。KLF8蛋白具有很强的EMT作用和侵袭性，为新发现的上皮细胞E-cadherin的抑制蛋白。KLF8蛋白为E-cadherin转录的内源性调节蛋白，它可以直接结合到E-cadherin启动子的TG盒，抑制基因启动子，从而降低E-cadherin的表达水平[7]。KLF8直接结合并抑制E-cadherin基因启动子，明显诱导上皮细胞向间质细胞发生转化，诱导EMT的发生，从而增强癌细胞运动性和侵袭力，从而促进肿瘤的发生与转移灶的形成[16-18]。本研究发现KLF8在结肠癌组织的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，表明KLF8的高表达与结肠癌的发生相关，并且在结肠癌组织中，KLF8随着TNM分期、浸润深度及淋巴结转移的进展其表达增加，提示KLF8的表达与TNM分期、浸润深度及有无淋巴结转移有关。

Snail是一类重要的转录因子,通过结合C-末端的锌指结构域和N-末端的SNAG(Snail/Gfi)结构域来调控靶基因的表达能力[19]。脊椎动物体内存在3种Snail蛋白: Snail1(即通常称作的Snail)、Snail2(即Slug)和Snail3。研究表明,Snail1的异常表达与肿瘤的侵袭性密切相关。在肿瘤的侵袭性表达中，Snaill被认为是一个关键因子，因为它在肿瘤转移相关的EMT途径中中起重要作用。Snail1属于锌指蛋白转录因子家族的成员，可以直接或间接通过调控钙黏素(E-cadherin)诱导肿瘤发生EMT。Snail1通过识别靶基因启动子的E-box基序的DNA结合序列，使E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达削弱，改变癌细胞的表型，降低了细胞间的黏附，增加了细胞侵袭的能力，并诱导基底膜屏障的破坏[7，20]。Snail1异常表达与侵袭型肿瘤密切相关[21]。有研究分析得出，Snail1 在非小细胞肺癌组织中表达相比于正常非癌组织明显升高。提示Snail1基因在正常器官与组织中保持沉默状态，当其在肿瘤等病理条件下时，其被再激活使其表达水平提高[22]。Snaill基因在正常组织中沉默，而在肿瘤的病理状态下可能为肿瘤的环境刺激作用而使该基因的表达上调，继而通过控制相关蛋白的表达来发挥特定的功能作用。本研究发现，Snail1在结肠癌组织的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，且Snail1在结肠癌组织表达与TNM分期、浸润深度及有无淋巴结转移有关。但在结肠癌组织中Snail1的表达与KLF8的表达之间不存在相关性，提示KLF8与Snail1两者通过不同的途径作用于E-cadherin，诱导EMT的发生，从而参与结肠癌的发生、发展。

综上所述， KLF8通过直接结合到E-cadherin启动子的TG盒，抑制基因启动子，从而诱导EMT的发生参与结肠癌的发生、发展；而Snail1 通过识别靶基因启动子的E-box基序的DNA结合序列，下调E-cadherin的表达，从而诱导EMT的发生来参与结肠癌的发生、发展。由此可见，KLF8与Snail1在调节EMT的过程中可能通过发挥并行的角色来参与E-cadherin的下调，从而促进其上皮间质化的发生，进一步促进肿瘤细胞的侵袭和转移。故通过检测这两种因子在结肠癌组织中的表达，可能对判断结肠癌的恶性程度及预后具有一定的临床价值，同时可能为结肠癌的临床治疗提供新靶点。