紫草素纳米结构脂质载体制备与质量评价研究

史 凡, 杨 红

(首都医科大学 燕京医学院, 北京 100069)

紫草素(Shikonin,SN)是从传统中药紫草中提取的一类萘醌类化合物,具有抗炎、镇痛作用、抗病毒和抗菌作用、抗肿瘤、抑制脂肪生成等作用[1-2],其广泛的药理与临床作用日益受到人们的重视。目前,国内外对紫草中化学成分、药理作用、提取工艺的研究较全面和深入[3-4],对紫草素在动物体内的吸收特性也有了一定研究[5-6]。而针对制剂方面的研究还不够完善,仅有脂质体、微乳等方面的初步研究报道[7-8]。临床应用的制剂通常存在释药不规则、质量不稳定等诸多不足,尚不足以解决紫草素在水溶液中溶解度极低,毒性大且缺乏选择性[9]的问题。

纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carriers, NLC)是在固体脂质纳米粒的基础上发展起来的一种新型的药物纳米载体,是由几种不同结构、互不混溶的固液脂质构成的一种具有特殊结构的脂质填充体系[10-11]。目前国内外对纳米结构脂质载体的研究技术较为成熟[12-13],已充分证实可提高难溶性药物的溶解度,促进药物的充分溶解[14],促进药物在胃肠道的吸收[15]。目前专门针对紫草素的纳米结构脂质载体的制备研究尚未开展。本实验拟设计制备载有紫草素的纳米结构脂质载体(SN-NLC),对其理化性质与体外释放进行测定及评价,为后期的进一步研究奠定基础。

1 仪器与材料

仪器:高压乳匀机(GEA, Niro Soavi S.P.A., Italy),透射电子显微镜(JEM-1230, JEOL, Japan),紫外可见分光光度仪(UV-762上海精密科学仪器有限公司),分析天平(BS124S Sartoriusd=0.0001),恒温磁力搅拌器(S21-2 上海司乐仪器有限公司),激光纳米粒度仪(BROOKHABEN Instruments Corporation),KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),振荡摇床(Forma Orbital Shaker,Thermo),透析袋(Solarbio,Mw=7000)等。

材料:紫草素(中国食品药品检定研究所),单硬脂酸甘油酯、中碳链三甘酯(天津市光复精细化工研究所),吐温-80(中国国药集团化学试剂有限公司),各种无机盐和有机溶剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 紫草素纳米结构脂质载体的制备

紫草素纳米结构脂质载体由高压乳匀法制备。首先称取处方量的固相脂质单硬脂酸甘油酯和液相脂质中碳链三甘酯于茄形瓶中,水浴加热,待固液相脂质熔融后,搅拌下滴加入紫草素的乙醇溶液；同时称取处方量的吐温-80搅拌分散于磷酸盐(pH7.4)缓冲溶液中,搅拌下,滴入熔融的固液脂质中,继续搅拌制得预乳化液；同温(1.0～1.2)×108Pa下采用高压乳匀机循环乳匀5次,室温冷却后得到紫草素纳米结构脂质载体。

2.2 粒径分布、Zeta电位测定方法及形态学观察

纳米结构脂质载体粒径分布和Zeta电位由激光纳米粒度分析仪测量,其中粒径采用强度分布(Intensity distribution)的结果,多分散性指数(Polydispersity Index, PI)采用单峰分布(unimodal distribution) 的结果。粒径和Zeta电位均测定3次,取平均值。

采用透射电镜观察纳米结构脂质载体的微观形态。取样品溶液,用蒸馏水稀释,取10 μL置于铜网表面,下衬滤纸,空气中自然挥干后,于电镜下观察。固定电镜电子束电压为80 kV,移动坐标,调节放大倍数,寻找观察粒子并拍照。

2.3 纳米结构脂质载体中紫草素的测定

2.3.1 检测波长的选择

精密移取紫草素纳米结构脂质载体供试液,空白纳米结构脂质载体供试液以及紫草素对照品适量,用甲醇稀释后,在200～800 nm范围内扫描。结果发现紫草素纳米结构脂质载体中紫草素与紫草素对照品在516 nm波长处均有最大吸收峰,而空白纳米结构脂质载体在此波长处无吸收,对测定无干扰。因此选定516 nm作为测定药物含量的波长。

2.3.2 标准曲线的绘制

精密称取紫草素标准品适量,用甲醇配制成质量浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0mg/L溶液,以甲醇为空白对照,在516 nm处测定其吸收度A。得到标准曲线方程为A=0.016 8C+0.016 1(R=0.999 8),C紫草素质量浓度。表明紫草素对照品在0.5～40.0 mg/L浓度范围内,与吸光度呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度与回收率实验

取上述紫草素对照品溶液0.5、10、40 mg/L(低、中、高)3个质量浓度,早、中、晚重复测定3次,连续测定3 d,计算得日内RSD分别为1.07%、0.59%、0.67%；日间RSD分别为1.44%、0.86%、1.28%,表明日内、日间精密度较好。

制备空白纳米结构脂质载体,分别量取空白纳米结构脂质载体 100 μL,分别加入0.5 g/L 的紫草素母液,用甲醇逐级稀释定容至10 mL棕色容量瓶中配制成0.5、10、40 mg/L(低、中、高)3个质量浓度的溶液,早、中、晚重复测定3次,按标准曲线计算回收率。结果表明,低、中、高3个质量浓度的紫草素回收率分别为99.2%(RSD=0.73%)、100.13%(RSD=0.66%)、98.73%(RSD=1.17%),表明回收率良好,空白纳米结构脂质载体即辅料对测定结果无干扰。

2.3.4 包封率的测定

精密吸取紫草素纳米结构脂质载体供试液1.0 mL,上样经处理的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50柱(长度20 cm,内径1 cm),用磷酸盐(pH7.4)缓冲液洗脱,流速1 mL/min,收集样品,每管2.0 mL,将上述各管收集液分别置10 mL容量瓶,用甲醇定容；超声2 min,摇匀；设置波长516 nm测定药物含量,考察流出曲线,计算包封率。

2.4 采用正交试验设计法优化处方

在预试验的基础上,选择对紫草素纳米结构脂质载体影响较大的3个因素,即固相脂质与液相脂质重量的比值(E)、药物与总脂质重量的比值(F)、乳化剂的质量分数(G),采用正交试验设计法,按照L9(33)正交表设计成3因素3水平的正交试验,以粒径和包封率为参考指标对处方进行进一步筛选,详见表1。

表1 紫草素纳米结构脂质载体的正交试验设计表

2.5 体外释放度考察

采用动态透析法,精密移取紫草素纳米结构脂质载体2 mL于已活化好的透析袋中,两端用透析夹加紧,置于装有40 mL溶出介质(pH7.4)的具塞锥形瓶中；放入37 ℃空气恒温振荡器中,100次/min振荡,于1、2、4 、8 、12、24、48、72 h取样,并更换新鲜透析介质。取出的样品在波长516 nm处测定药物含量。同时以游离药物紫草素的释放作对照。根据公式计算各时间点相对累积释放率(相对累积释放率=某个时间点取样测定的总量/72 h的最终释放量),绘制释放曲线。

3 结果

3.1 正交试验设计法优化处方结果

按L9(33)正交表设计成3因素3水平的正交试验,以粒径(PS)、包封率(EE)为参考指标对处方进一步筛选,试验结果见表2。可得最优处方为A2B3C3,即固相脂质与液相脂质重量的比值为1∶1,药物与总脂质重量的比值为1∶25,乳化剂的重量百分比为1.5%。

表2 紫草素纳米结构脂质载体的正交试验设计结果及分析

3.2 粒径分布、Zeta电位、包封率及形态学观察

取由优化处方制备的紫草素纳米结构脂质载体样品溶液,蒸馏水稀释100倍后,用激光纳米粒度分析仪测量粒径分布和Zeta电位,粒径结果为(209.7±3.4) nm,Zeta电位为(-34.57±1.53) mV,Zeta电位结果表明制备的紫草素纳米结构脂质载体体系的稳定性良好。采用葡聚糖凝胶G50柱分离,紫外分光光度法测定紫草素纳米结构脂质载体的包封率为(91.66±3.08)% 。

观察紫草素纳米结构脂质载体样品溶液的外观均一稳定,无沉淀,具有紫红色乳光(图1(a))。透射电镜下观察为圆形小球,分散均匀,形状规整,大小在200 nm左右(图1(b))。与激光纳米粒度仪测定结果相吻合。

图1 紫草素纳米结构脂质载体的外观形态与透射电镜结果

3.3 体外释放结果

紫草素纳米结构脂质载体的体外累积释放曲线见图2(R为累积释放率)。由图可得,游离药紫草素在12 h累计释放量已达到(92.06±1.56)%,紫草素纳米结构脂质载体在12 h内累计释放仅达到(66.40±1.12)%,72 h后达到(89.75±0.91)%。进一步观察释放曲线,与游离药紫草素相比,紫草素纳米结构脂质载体表现出明显的缓释行为,呈现先突释,后缓释的效果。

图2 紫草素纳米结构脂质载体的体外累积释放曲线

对紫草素纳米结构脂质载体累积释放率R与时间t按照零级、一级、Higuchi、Weibull和Korsmeyer-Peppas方程进行拟合,结果见表3。结果表明,以Weibull方程拟合的相关系数最大,说明该方程能较好地描述紫草素纳米结构脂质载体的体外释药特征。

表3 紫草素纳米结构脂质载体的释放曲线拟合结果

4 讨论

纳米结构脂质载体采用混合脂质为载体,将常温下为液态的脂质加入到固态脂质中,使晶体混乱度增加,承载药物空间增大,是特殊骨架材料的纳米粒,能够保护药物免受降解,提高稳定性,改善药物的药理学与药代学性质,目前已成为国内外新剂型研究热点[16]。本实验采用高压乳匀法制备,正交试验设计法筛选出最优处方,得到的紫草素纳米结构脂质载体外观圆整,粒径分布均匀,体系稳定,优化的制备条件重复性较好。

体外释放实验中紫草素纳米结构脂质载体呈现先突释、后缓释的效果,分析原因可能由于药物分子一部分吸附或嵌在纳米结构脂质载体表面,另一部分镶嵌在纳米结构脂质载体的骨架中或被包裹在其内部。吸附在表面或表层的药物快速释放,构成释放曲线初始阶段的突释结果,之后被包裹的药物从纳米结构脂质载体骨架中扩散出再释放,构成释放曲线后段的缓释结果。说明纳米结构脂质载体以先快后慢的方式释放紫草素,推测在体内先释放的药物可迅速起效,后缓释释放的药物可以持续作用,获得更好的治疗效果。后续实验将对紫草素纳米结构脂质载体的体内转运吸收特性做更深入的研究,以期为高效低毒、稳定安全的药物新剂型研究提供科学依据。