蛋白质动态运动在生物化学实验中的教学实践

史 影, 王伟伟, 叶伶燕, 周耐明

(浙江大学 生命科学学院, 浙江 杭州 310058)

当前高校生物化学实验教学的内容主要以体外非细胞体系的检测性实验为主,如酶的活性检测、蛋白质浓度测定、酶促反应动力学以及聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量等等,对于细胞内蛋白质的动态变化及运动涉及很少。利用G蛋白偶联受体内吞原理,通过荧光蛋白显微成像技术,让学生观察并实践了受体蛋白在细胞中的内吞过程和回膜运动,同时还观察了下游招募蛋白的定位和运动。该实验模型还可用于膜受体内吞机制的基础研究以及受体药物筛选,是个值得推广并便于实践的生化实验。

1 实验原理

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是一类高度保守的细胞膜蛋白超家族,广泛存在于从真菌到哺乳动物的生命体中。细胞外信号通过GPCRs将信息传递至细胞内并通过效应系统发挥广泛调控作用[1]。GPCRs 与人类疾病如肥胖、糖尿病、骨质疏松、肿瘤、炎症、甚至 HIV 病毒感染等都密切相关,所以 GPCRs一直也是研发新药的主要药靶[2-3]。当GPCRs的激动剂持续存在时,会在几分钟至几小时内引起细胞膜表面的受体数量降低,即发生内吞(internalization)。随后,GPCRs会出现反应性降低的现象，即受体失敏(desensitization)[4-6]。GPCRs的内吞及失敏是调节GPCRs介导的信号转导及效应的重要机制。内吞后受体通常有两种去路,一是通过内含体(endosome)再循环回到细胞膜表面,完成复敏;二是被送到溶酶体中发生不可逆的降解[7]。

GPCRs的内吞过程伴随一系列分子事件。在特定激动剂诱导下,GPCRs构象发生改变,构象改变后的受体被第二信使依赖的激酶PKA、PKC等或G蛋白偶联受体激酶GRKs识别并发生快速磷酸化。磷酸化后的受体招募β-arrestins从细胞质转位至细胞膜。GPCRs与arrestins的结合引起arrestin构象改变,促进其C端结构域暴露,暴露的C端结构域进一步与笼型蛋白(clathrin)和笼型蛋白适配器AP-2(adaptor protein complex-2)的β2衔接蛋白亚基(β2-adaptin subunit)发生相互作用。接着该复合体通过网格蛋白包被的小窝(clathrin coated pits, CCPs)在dynamin的发动下发生内吞[8-11]。

受体内吞模型研究常用绿色荧光蛋白GFP作为重要工具。GFP有2个吸收峰,主峰在395 nm,次峰在470 nm,其荧光发射峰在509 nm。GFP的突变体增强型荧光蛋白EGFP(enhanced green fluorescent protein)改善了GFP在37 ℃的折叠能力,显著提高了GFP的光谱性质,并大大增强了荧光强度和光稳定性。突变后的EGFP激发峰转移至488 nm,而发射峰仍保持在509 nm,这和常用的FITC滤光片匹配,提高了GFP的应用潜力[12-13]。本实验通过常规的基因操作,将趋化因子受体FPR1与EGFP在细胞中融合表达,观察FPR1的细胞内定位及内吞过程,以及对β-arrestins的招募作用。

2 实验步骤

2.1 质粒提取及检测

实验所用质粒为FPR1-pEGFP、PCMV-FPR1、β-arrestin1-pEGFP、β-arrestin2-pEGFP。将所用质粒转化至大肠杆菌中,摇菌扩大培养。用去除内毒素的质粒提取试剂盒提取相关质粒,用紫外分光光度法对所提质粒进行定性定量分析。

2.2 细胞培养

实验所用细胞株为人胚胎肾细胞HEK293,用含10%FBS的DMEM/Low Glucose培养基,在37 ℃,5%CO2培养箱中培养。待细胞汇合度达到80～90%时,以1∶3～1∶5的稀释度传代。

2.3 转染

将处于良好生长状态的HEK293细胞,以3×105～5×105的密度接种于6孔培养板中。在37 ℃,5%CO2培养箱中继续培养18～24 h,待细胞汇合度达到80%～90%时,选用Lipofectamine 2 000进行转染。转染后培养4～6 h换新鲜培养基,继续培养8～12 h。

教师推荐转染方案,6孔板中的其中2孔细胞转染FPR1-pEGFP,用于直接观察FPR1-GFP受体蛋白的内吞,2孔细胞共转染PCMV-FPR1和β-arrestin1-pEGFP,另两孔细胞共转染PCMV-FPR1和β-arrestin2-pEGFP,后四孔细胞用于观察FPR1被配体激活后辅助蛋白β-arrestins的动态变化。学生可根据自己的设计调整方案。

2.4 受体定位及内吞研究

2.4.1 细胞准备

将6孔板中转染后的HEK293细胞,平均分配于事先置有灭菌盖玻片的6孔板中,让细胞在盖玻片上生长。37 ℃,5%CO2培养箱中培养18～24 h,使在进行实验的当天细胞达到70%～80%的汇合度。其中2孔提前加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮过夜培养。

2.4.2 激动剂刺激和细胞固定

加5 μM FPR1激动剂fMLP于FPR1-pEGFP转染细胞中分别孵育0、5、30、45 min,用于观察激动剂处理不同时间受体蛋白的定位及内吞运动；配制不同浓度的激动剂fMLP(用DMEM稀释),作用于FPR1-pEGFP转染细胞,于37 ℃,5%CO2培养箱中孵育45 min,用于观察不同浓度激动剂对FPR1受体内吞的影响；在放线菌酮处理的细胞中加入激动剂刺激45 min,再去除激动剂,1 h后观察受体蛋白的去路。

在PCMV-FPR1和β-arrestin1-pEGFP, PCMV-FPR1和β-arrestin2-pEGFP 共转染细胞中,加入激动剂fMLP,作用不同时间,观察β-arrestin1和β-arrestin2的定位及变化。

孵育完毕后将细胞培养基从待检细胞中吸出, 用PBS 漂洗细胞。漂洗后, 4%多聚甲醛室温固定10 min,将玻片从6孔板中取出,置于事先滴有甘油的盖玻片上,封片。

2.4.3 细胞定位及内吞观察

荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜下观测绿色荧光蛋白的分布。

3 实验结果讨论

3.1 观察激动剂作用不同时间FPR1从细胞膜到胞浆的内吞运动

用FPR1激动剂fMLP(5 μM)刺激转染有FPR1-pEGFP的细胞,37 ℃,5%CO2培养箱中分别孵育0、5、30、45 min,荧光显微镜或confocal观察FPR1-pEGFP融合蛋白的定位。结果如图1所示,0 min即不加激动剂时,受体蛋白主要表达在细胞膜上；5 min时部分受体蛋白已形成颗粒状向细胞内迁移即内吞,但细胞膜上还存有部分受体蛋白；30 min时,内吞颗粒增加且进入细胞更内部；45 min后绝大部分受体蛋白集中在胞浆某一区域,细胞膜上基本看不到受体蛋白。图1中清楚地展示了膜受体蛋白的内吞过程。

图1 激动剂处理不同时间的FPR1-pEGFP内吞

3.2 观察不同浓度激动剂作用于FPR1后,引起的FPR1受体内吞

用不同浓度(1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L)的FPR1激动剂fMLP刺激转染有FPR1-pEGFP的细胞,37 ℃,5%CO2培养箱中孵育45 min,荧光显微镜或confocal观察FPR1-pEGFP融合蛋白的定位。结果如图2所示,在低浓度10 nmol/L激动剂刺激下,受体蛋白基本没有内吞,在100 nmol/L时有部分内吞,1 μmol/L时几乎全部内吞。由此理解受体蛋白内吞数量与激动剂浓度正相关的内在机制。

图2 不同浓度激动剂处理下FPR1-pEGFP的内吞

3.3 观察FPR1受体内吞后,撤去激动剂1 h后受体蛋白的去路

内吞后的受体通常有2条去路,到溶酶体中被降解或重新回到膜上发挥功能。具体采用哪条去路与受体的性质有关。在用放线菌酮预处理细胞,抑制新受体蛋白合成的情况下,激动剂刺激45 min使受体内吞,然后换液撤去激动剂,1 h后发现内吞的FPR1重新回到细胞膜上,说明内吞后的FPR1受体会重新回到细胞膜再循环使用，见图3所示。

图3 FPR1受体内吞后去路观察

3.4 观察FPR1受体内吞过程中,β-arrestin1和β-arrestin2的运动变化

将PCMV-FPR1和β-arrestin1-pEGFP, PCMV-FPR1和β-arrestin2-pEGFP 分别共转染至细胞中,加激动剂fMLP作用不同时间,结果如图4所示。在0 min即不加激动剂时,β-arrestin1和β-arrestin2主要分布在胞浆中,激动剂加入1 min时β-arrestin1已向细胞膜分布,到5 min时细胞膜定位更明显,随着时间的延长,到15 min时,β-arrestin1重新回到胞浆；在激动剂处理过程中β-arrestin2也出现了胞浆-细胞膜-胞浆的运动过程,1 min时细胞膜定位最明显,5 min时已向胞浆迁移。该实验反映了β-arrestin1和β-arrestin2蛋白都参与了FPR1受体内吞过程,且并不完全同步,相关机制还可设计实验做进一步研究。

图4 FPR1受体内吞过程中β-arrestin1和β-arrestin2的招募

4 实验安排及效果

本实验安排在高级生物化学实验课程中,可连续4～5 d,共12～18 h。中间设置开放环节,如激动剂浓度选择,处理时间选择,对照设置,FPR1与其他下游蛋白的相互作用等,或者学生其他感兴趣的环节。实验过程强调直观现象与分子机制的契合理解,实验对照组的设置,拓展性实验的思考,并学习正确的荧光蛋白显微成像技术。多年教学实践显示该实验内容丰富、综合性强、学生学习积极性高。

5 结语

当前荧光蛋白技术被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位和转运、蛋白折叠、生物分子相互作用等研究领域[14-15]。在本科生高级生物化学实验中,我们用绿色荧光蛋白EGFP作标记,在荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜下观察G蛋白偶联受体FPR1的定位和内吞运动,以及其下游蛋白β-arrestins的招募过程。该实验一方面使学生观察到不同条件及动态变化中蛋白质的定位及运动；另一方面,在具体实验中也学习了相应的蛋白显微成像技术及图像处理方法,拓展了生物化学的本科教学实验内容。另外,由于本实验结果非常直观,也有效地调动了学生的实验积极性和兴趣。该实验对学生进一步认识蛋白质在信号刺激及系列分子事件中的运动及相关机制起到了很好的启示作用。