玫烟色棒束孢Pr1酶活力、Pr1酶基因表达量与其毒力的相关性

王宏民，李赫，张天浩，张仙红

1 山西农业大学 经济管理学院，山西 太谷 030801

2 山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801

虫生真菌在入侵寄主的过程中，通过分泌蛋白酶、几丁质酶和脂酶等多种水解酶来降解昆虫体壁[1]，从而入侵寄主昆虫。其中丝氨酸弹性凝乳蛋白酶Pr1是一类能高效降解昆虫体壁蛋白的重要酶[2]。据报道，球孢白僵菌Pr1酶在球孢白僵菌侵入虫体过程中起重要作用，且经过基因改良可过量分泌蛋白酶和几丁质酶的白僵菌菌株其毒力显著增强[3]；绿僵菌中也已发现有10种丝氨酸弹性凝乳蛋白酶 (Pr1A-Pr1K)，且将Pr1基因导入绿僵菌中超量表达获得的重组菌株其侵染力明显提高[4]；玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea表皮蛋白酶基因敲除型菌株对烟粉虱若虫的致死率显著低于对照[5]。可见，Pr1酶是虫生真菌的一个重要的毒力因子。

玫烟色棒束孢是一种地理分布广泛、昆虫寄主多样的虫生真菌。早在1961年，有关学者就开始利用感染玫烟色棒束孢的棉铃虫进一步感染黏虫、斜纹夜蛾和铜绿金龟子的幼虫[6]。用玫烟色棒束孢北京变种显著降低了温室黄瓜上的白粉虱的种群数量[7]。近年来，有关玫烟色棒束孢致病机理[8-11]、毒力基因克隆和表达[12]、致病相关基因的差异表达[13]等已陆续得到了研究。毒力基因高表达是提高昆虫病原真菌毒力和进一步扩大真菌杀虫剂应用的有效手段[14]。那么不同毒力的菌株其Pr1蛋白酶基因的表达是否存在差异，这种差异与其毒力的相关性如何，目前还未见报道。本试验采用荧光定量PCR技术检测了毒力不同的玫烟色棒束孢菌株Pr1酶基因的表达量，旨在探讨玫烟色棒束孢Pr1酶活力、Pr1酶基因表达量与其毒力之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

玫烟色棒束孢Pf-9606、Pf-7606、Pf-904、Pf-941、Pf-14菌株保存于山西农业大学昆虫实验室。

1.2 供试昆虫

采集个体大小一致的无翅桃蚜，用新鲜离体的桃树叶片 (叶柄用湿棉球包裹) 在 (25±1)℃、相对湿度 (75±5)%、12 L∶12 D光照条件下进行饲养。

1.3 供试药剂

Pr1 蛋白酶专一性短肽底物 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，购自Sigma公司。

试剂盒TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (AH311)、TransStart Tip Green qPCR SuperMix，购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech) 有限公司。

考马斯亮蓝染色液：0.1 g/L考马斯亮蓝G-250，47 g/L乙醇，85 g/L磷酸。

冰醋酸、EDTA均为分析纯。

1.4 毒力测定

对桃蚜的毒力测定采用坡塔喷雾法。取PDA培养基 (马铃薯200 g，葡萄糖200 g，琼脂200 g，蒸馏水1 L) 上培养10 d的供试菌株的分生孢子，用无菌水配制成1×107孢子/mL的孢子悬浮液，每个培养皿中放入30头桃蚜，用坡塔喷雾器进行喷雾，每皿喷雾量设置为1 mL，沉降时间为40 s。每处理3次重复，用无菌水作对照。逐日定时观察、记录各个处理的桃蚜死亡情况，并将死亡蚜虫尸体移出放入消毒的培养皿中，26 ℃保湿培养。采用SPSS软件进行数据处理。

1.5 Pr1蛋白酶活性测定

粗酶液的制备：将湿重7.5 g的菌丝接入100 mL基本盐培养基 (NaCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，K2HPO40.3 g/L) 中，于26 ℃、180 r/min的恒温振荡培养箱中培养24 h，除去菌体得到粗酶液。

菌株Pr1蛋白酶活性的测定参照Gille-spie等专一性短肽底物法[15]。将1.4 mL Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L，pH 8.0)、50 μL粗酶液和50 μL Pr1底物混匀，28 ℃、180 r/min摇床振荡10 min，冰浴1 min后终止反应，410 nm测定混合液的吸光率，用50 μL DMSO代替Pr1底物设为空白对照。每个菌株3次重复。酶活单位定义：以pH 8.0、28 ℃使反应混合物每分钟的OD410平均增加0.01的酶量为一个酶活单位，酶活以活力表示，计算比酶活 (单位：U/mg)。

数据处理：运用SPSS软件进行一元线性回归分析，将供试菌株的Pr1酶活力与致病力进行相关性分析。

1.6 蛋白质浓度测定

利用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准品，测定蛋白含量。

1.7 Pr1蛋白酶基因表达量测定

1) 按照TransZol Up Plus RNA Kit说明书提取供试菌株的总RNA；恒压300 V，1.5% TAE琼脂糖凝胶电泳5 min检测RNA；取1 μL RNA样品，用紫外分光光度计测定提取的各样品的总RNA浓度及OD260/OD280值。

2) 使用 TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (AH311)试剂盒，反转录玫烟色棒束孢的RNA样品。反应体系包含1 μg Total RNA、10 μL 2×TS II Reaction Mix、1 μL TransSctipt II RT/RI Enzyme Mix、0.5 μL Random Primer (0.1 μg/μL)、0.5 μL Anchored Oligo (dT)20 Primer (0.5 μg/μL) 和1 μL gDNA Remover及20 μL RNase-free Water。先将RNA模板、引物与RNase-free Water混匀，65 ℃孵育5 min后，冰浴2 min，然后再加入其他反应组分，50 ℃孵育反转录15 min；85 ℃加热5 min失活TransScript II RT/RI和gDNA Remover。

3) 荧光定量PCR引物设计见表1：根据汤强提交的IfuPr1的cDNA序列 (GenBank登录号FJ423001.1)[12]，用Primer Premier 5软件设计qPCR引物，以延长因子 (Elongation factor) 基因作为内参基因。

表1 引物设计Table 1 Design of primer

4) 荧光定量反应体系和条件：使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒，反转录玫烟色棒束孢的RNA样品，反应体系包含1 μL Template、0.4 μL Forward Primer (10 μmol/L)、0.4 μL Reverse Primer (10 μmol/L)、10 μL 2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix、0.4 μL Passive Reference Dye (50×，optional)、20 μL ddH2O。

PCR 反应程序：94 ℃预变性 30 s，94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40-45个循环。

5) 数据处理：当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2–△△CT法计算不同玫烟色棒束孢Pr1蛋白酶基因相对于对照组的表达量，不同菌株间差异显著性用SPSS进行单因素的新复极法数据分析。所有数据用±s表示。柱状图用软件Excel绘制。

目的基因的相对表达水平=目的基因与内参基因的倍数差异 (未知样本) /目的基因与内参基因的倍数差异 (对照样本)。

Relative Quantity=2–△△CT。

6) Pr1酶活力、基因表达量与毒力的关系：运用SPSS软件进行多元线性回归分析，多重比较运用了共线性分析法。将供试菌株的Pr1酶活力、蛋白酶Pr1基因表达量与致病力进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 供试菌株对桃蚜的毒力及Pr1酶活力

供试菌株对桃蚜的毒力及不同菌株的Pr1酶活力如表2所示。由表2可知，不同菌株对桃蚜的毒力及Pr1酶活力存在一定的差异。其中菌株Pf 904毒力最高，对桃蚜的致病力达94.13%，致死中时最短为2.29 d，Pr1酶活力最高为0.085 7 U/mg；其次为Pf 7606菌株，其毒力和酶活均显著低于Pf 904菌株，其他供试各菌株毒力的变化趋势与Pr1酶活力变化基本一致。

2.2 Pr1蛋白酶基因表达量

由图1可知，供试玫烟色棒束孢不同菌株Pr1酶基因表达量存在一定差异。玫烟色棒束孢Pf 904和7606的基因表达量较高，且这两菌株的毒力也最高，分别为对照的5.9倍和5.8倍；而玫烟色棒束孢14、9606、941的基因表达量较低，依次为对照的5.2、4.8、3.1倍，且其毒力也呈逐渐趋势。

2.3 供试菌株的致病力、Pr1酶活力及表达量的相关性分析

2.3.1 供试菌株Pr1酶活力与毒力的相关性

以Pr1酶活力为自变量，毒力为因变量，采用SPSS皮尔逊相关分析法，分析自变量与因变量的相关性及自变量对因变量的被贡献程度。对供试5菌株的Pr1酶活力与致病力作散点图，经线性趋势拟合，得到不同菌株的Pr1酶活力与致病力的线性回归分析方程：y=3.64x+0.62，R2=0.432，相关系数达到了极显著水平 (图2)。由此可知，Pr1酶活力与供试菌株的致病力呈正相关，菌株的Pr1蛋白酶活性越高，致病力越强。

表2 供试菌株对桃蚜毒力及Pr1酶活力Table 2 Virulence and Pr1 protease activity of tested strains

图1 各菌株Pr1基因相对表达量Fig.1 Pr1 gene relative expression of the strains.

图2 玫烟色棒束孢及球孢白僵菌Pr1酶活力与菌株致病力的相关性Fig.2 The correlation between Pr1 protease activity and strain lethality of I.fumosorosea and B.bassiana.

2.3.2 供试菌株Pr1酶活力、基因表达量与毒力的关系

以Pr1酶活力、Pr1基因表达量为自变量，毒力为因变量，采用SPSS共线性分析，分析了自变量与因变量的相关性与自变量之间的交互作用。结果表明，残差符合正态分布 (图3)，散落各点符合多元线性回归方程 (图4)，残差排列散乱毫无规律，说明结果比较理想 (图5)。

对供试菌株Pr1酶活力、Pr1基因表达量与致病力进行多元线性回归分析，得到方程为y=0.236+10.833x1–0.039x2(x1=Pr1酶活力，x2=Pr1基因表达量)：调整R2=0.568，说明线性拟合方程能很好地反映原始数据；序列相关系数D-W为2.444，表明方程不存在序列相关，不是伪回归方程；P(x1=0.367，x2=0.512)<0.05，表明Pr1酶活力、Pr1基因表达量对致病力有显著影响；VIF=12.705，证明Pr1酶活力、Pr1基因表达量存在中度多重共线性。由此可知，Pr1蛋白酶基因表达量与Pr1酶活呈正相关，Pr1蛋白酶活力与菌株的致病力呈正相关，故Pr1蛋白酶活力、Pr1蛋白酶基因表达量均与菌株的致病力存在着一定程度的共线性。

图3 残差直方图Fig.3 Histogram of residuals.

图4 回归标准化残差的标准P-P图Fig.4 Standardized regression residuals of the standard P-P figure.

图5 残差散点图Fig.5 Residual scatterplot.

3 结论与讨论

多数研究表明，昆虫病原真菌分泌的蛋白酶活力与其毒力之间存在密切联系[16]，如球孢白僵菌菌株的胞外蛋白酶产酶水平高低决定了其对红脂大小蠹致病力的强弱，二者之间呈明显的线性关系[17]；蝉拟青霉胞外蛋白酶活性与对蚜虫的致病力的作用效率具有相关性[18]；白僵菌不同菌株的酶活力与其对害虫的致病力关系为一次函数[19]；球孢白僵菌GXU-Bb及其分离子菌株GXU-Bb16、GXU-Bb10、GXU-Bb13和GXU-Bb05两种类型的菌株产酶水平的高低差异与其对小菜蛾的致病力间有显著或极显著相关性[20]。本试验也表明，供试的玫烟色棒束孢Pr1酶活力与其毒力存在线性关系，且相关系数达到了极显著的水平。可见进行玫烟色棒束孢高毒力菌株的初步筛选时，Pr1酶活力可作为一个重要的参考指标。但由于昆虫病原真菌在侵染昆虫体表时分泌一系列的体壁降解酶，而不同酶对不同体壁成分结构的昆虫发挥的作用可能不完全相同，因此，应进一步深入研究玫烟色棒束孢在侵染不同目昆虫时其蛋白酶活力与其毒力的相关性。

据St Leger等报道，将Pr1基因导入绿僵菌中超量表达获得的重组菌株其侵染力明显提高；增加绿僵菌Pr1基因的拷贝数使其超量表达蛋白酶Pr1，不仅极大地提高了绿僵菌的毒力，而且使其对寄主昆虫的致死时间缩短了25%；通过基因工程手段促使绿僵菌超量表达降解表皮的蛋白酶PR1，可构建高毒力杀虫绿僵菌工程菌株[4]，可见毒力基因高表达是提高昆虫病原真菌毒力和进一步扩大真菌杀虫剂应用的有效手段。本试验通过荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现，玫烟色棒束孢不同菌株Pr1蛋白酶基因的表达量与Pr1酶活呈正相关，且不同菌株Pr1基因表达量差异与菌株本身的毒力大小一致，也与本研究生物测定的结果一致。可见，Pr1基因的表达量和Pr1蛋白酶的活力对玫烟色棒束孢菌株的筛选具有重要作用。

本研究采用荧光定量PCR方法，以EF延伸因子为内参，建立了一种快速准确检测不同菌株Pr1蛋白酶基因表达量的方法。该方法方便、高效，并具有良好的重复性，可用于玫烟色棒束不同菌株同一基因表达量的检测，这为高效筛选性状优良菌株提供了有效的技术手段。