早胜牛钙蛋白酶Ⅰ基因（CAPN1）多态性分析

石福岳，容维中，高 博，徐建峰，王燕燕，董 和，张艳丽

（1.甘肃省畜牧兽医研究所，平凉 744000；2.平凉市农产品质量安全检测检验中心，甘肃 平凉 744000）

钙蛋白酶（Calpain）是一种广泛存在于大多数动物细胞内的半胱氨酸蛋白酶，通过对细胞骨架蛋白、磷酸酶和蛋白激酶的作用，参与细胞凋亡、细胞增殖与分化、信号转导等［1］。钙蛋白酶主要位于骨骼肌中的肌纤维Z盘附近和肌质间膜上，分为p94、m-calpain和μ-calpain三种［2］。μ-calpain 又被称为CAPN1，可以被微摩尔级浓度的Ca2+激活。CAPN1 包含一个80 kD 的大亚基和一个30 kD 的小亚基，参与动物肌肉的生长，且在宰后通过引起肌肉中肌原纤维的水解导致动物肌肉的嫩化［3］。CAPN1基因作为影响肌肉嫩度的候选基因，其生理调控功能和分子生物学特性是近年来研究的重点和热点之一［4］。Page 等［5］通过直接测序的方法对牛群体CAPN1基因多态性位点进行了研究，在第9 外显子和第14 外显子各检测到一个错义突变，即外显子9 的G/C 之间的颠换，导致了蛋白质多肽链中第316 位氨基酸由甘氨酸变为丙氨酸，外显子14 的A/G 之间的转换，导致第530 位氨基酸有异亮氨酸和缬氨酸两种可能性。田璐等［6］采用PCR-RFLP 法检测中国西门塔尔牛CAPN1基因SNPs 位点的多态性，结果表明，CAPN1316 位点和CAPN14 751 位点分别发生C/G 颠换和C/T 转换，且两位点与牛肉大理石花纹以及剪切力相关。

早胜牛是陇东地区长期自然选育形成的优良地方类群，其体质结实、体驱紧凑、骨骼较粗、肌肉丰满、肉用性能好，已成为陇东地区养殖的主导肉牛群体。但是由于近年来盲目引种，造成牛种混杂，生产性能不稳定或下降，尤其是一些固有特性及优势基因逐渐流失，对其保护和利用形成了较大威胁。本研究通过DNA 池测序法检测早胜牛CAPN1基因22 个外显子的SNPs 位点，分析其多态性以及遗传多样性，为下一步分析其与早胜牛肉质的相关性打下基础，也为采用分子育种方法提高早胜牛肉用性能提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验早胜牛血样采自庆阳市宁县的早胜牛养殖场或专业合作社，共采集血样320 份，加抗凝剂摇匀后，置于-20℃冷冻保存备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取及DNA 混合池的构建 基因组DNA使用OMEGA 全血DNA 提取试剂盒提取，TE 缓冲液溶解，1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，并用分光光度计NanoDrop2000 测定浓度和OD260/OD280，将DNA 样品稀释至100 ng/μL。每个样本取5 μL，每10 个样本构成一个混合池，再以混合池为模板进行PCR 扩增。

1.2.2 引物设计及PCR 扩增 参考GenBank 数据库中牛的CAPN1基因序列（登录号：AH009246），使用软件Primer 5 及Oligo 6 进行引物设计，对早胜牛CAPN1基因的22 个外显子进行扩增，引物详细信息见表1。

表1 早胜牛CAPN1 基因引物信息

以DNA 混合池为模版进行PCR 扩增，PCR 反应体系为25 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol）、DNA 模版1 μL（100 ng），ddH2O 9.5μL。PCR 扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性35 s，退火30 s，72℃延伸30 min，32 个循环；最后72℃延伸10 min；产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，选取条带清晰、特异性良好的PCR 产物委托北京天一辉远生物科技有限公司进行测序。

1.3 数据的统计分析

将测序得到的DNA 序列用DNAStar 软件中的SeqMan、Editseq 等程序进行拼接，排列同源序列并进行人工校正，用DNAStar 软件中MegAlign 进行序列比对，以便分析其SNPs 位点。利用测序图看图软件Chromas和MWSnap 测量各SNP 位点等位基因峰高，根据以下公式估算等位基因频率［7］。

式中f i表示SNP 位点某等位基因频率，h1和h2分别表示测序图上该SNP 等位基因1、2 峰高度。

2 结果与分析

2.1 DNA 提取结果

采用试剂盒法提取的血液DNA，用核酸蛋白测定仪检测浓度和纯度，其OD260/OD280在1.8～2.0 之间。 1%琼脂糖凝胶电泳检测后结果如图1，结果显示，所提取的DNA 浓度较高，无杂带及拖尾现象。表明提取的DNA纯度较高，无蛋白质等杂质污染，可以用于后续试验。

图1 血液DNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果

2.2 PCR 扩增结果

以DNA 混合池为模版，用15 对引物分别对早胜牛CAPN1基因外显子进行PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测（如图2），由图2 可以看出，各引物扩增产物条带清晰，且特异性较好，与预期扩增产物大小一致。

图2 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测结果

2.3 序列分析

测序结果经DNAStar 软件的分析和比对，结果只有引物CA3、CA5、CA8、CA12、CA13 和CA14 的扩增产物检测到碱基突变（测序峰如图3）。CA3 引物扩增产物包括Exon5 和Exon6，在Exon5 的3 717 bp 处检测到一个G/A 突变，该突变为同义突变。在Exon6 的3 854 bp处检测到A/G 突变，导致异亮氨酸/缬氨酸突变。CA5引物扩增产物包括部分Exon8、全部Exon9 和部分Exon10，其中在Exon9 的5 709 bp 处检测到C/G 颠换，并引起丙氨酸/甘氨酸突变。CA8 引物扩增产物为部分Exon13 和全部的Exon14，其中Exon14 的11 058 位点发生G/A 突变，该碱基突变引起氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸。CA12 扩增产物包括Exon21 和部分Exon22，其中，在Exon22 的15 299 bp 处发生G/A 突变，但该突变为同义突变，未引起氨基酸的改变。CA13引物扩增产物包括部分Exon22，其中在15 682 处发生G/C 颠换，引起半胱氨酸/丝氨酸的突变。CA14 引物扩增产物为Exon10，与参考序列相比在6 004 bp 处发生C/T 突变，并导致所编码氨基酸由精氨酸突变为终止密码子。

图3 测序峰图

2.4 等位基因频率估算

利用MWSnap 软件的标尺分别测量7 个SNPs 等位基因峰高，根据公式估算各SNPs 位点的等位基因频率，结果见表2。如表2 所示，SNPs 位点C5709G 和C6004T 的突变型等位基因的频率均大于野生型等位基因的频率，而其余SNPs 位点的野生型等位基因频率均大于突变型等位基因的频率。

表2 各SNPs 位点等位基因频率估算结果

3 讨论

钙蛋白酶是一种广泛存在于动物细胞中的蛋白水解酶。大量的研究表明，CAPN 参与了肌肉中肌原纤维的水解过程，因此也直接参与了肌肉生长和畜禽屠宰后嫩化的过程。Smith 等［8］将影响猪肉嫩度性状的QTL位点定位在该基因上。长期以来，CAPN1基因的遗传变异及其对牛肉嫩度效应的相关研究较多。曹阳等［9］对草原红牛CAPN1基因第5 外显子进行SNPs 分析后，发现其第5 外显子存在A3717G 突变，突变后的多态导致牛肉剪切力值及肌纤维直径等肉质性状呈现不同程度的差异，表明该位点可能是CAPN1基因上一个重要的SNP 位点。武秀香等［10］采用PCR-SSCP 方法对中国黄牛不同群体中的CAPN1基因的遗传变异进行了研究，结果检测到A4558G 和C4684T 两个突变位点，并发现多态位点对牛肉嫩度和大理石花纹有显著效应，且A4558G 和C4684T 位点对肉嫩度的影响具有累加作用。张彩霞等［11］、陈晓杰［12］在不同类群牛CAPN1基因第9 外显子处分别检测到G458C、G5709C 突变，且G为优势等位基因。姜成国等［13］对草原红牛、延边黄牛CAPN1基因第14 内含子区4 685 位点进行了多态性与肉质嫩度分析，结果发现该位点存在C/T 突变，且该变异与肉嫩度、眼肌面积存在一定程度的相关性。

本研究采用DNA 混合池测序法对早胜牛CAPN1基因22 个外显子的多态性位点进行了研究，结果共检测到7 个SNPs 位点，包括G3717A、A3854G、C5709G、C6004T、G11058A、G15299A 和G15682A。其中，G3717A位于第5 外显子，但不会导致氨基酸的改变，属同义突变。这一结果与姜成国等［13］的研究结果一致。A3854G位于第6 外显子，导致氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸。C5709G 突变位于第9 外显子，导致氨基酸发生丙氨酸/甘氨酸突变，此结果与Page 等［5］、田璐等［6］、张彩霞等［10］、陈晓杰［11］等的研究结果一致。C6004T 突变位于第10 外显子处，这一碱基突变引起氨基酸由精氨酸变为终止密码子，可能会导致蛋白质翻译过程的终止，从而影响基因的表达过程。C5709G 和C6004T 两个SNPs 位点的突变等位基因频率高于突变前等位基因频率，其对早胜牛肉质性状等的影响还需要进一步研究。G11058A位于第14 外显子，并引起缬氨酸/异亮氨酸的突变，这一结果与Page 等［5］的研究结果一致。G15299A、G15682A位于第22 外显子，G15299A 为同义突变，未引起氨基酸的改变，而G15682A 突变引起氨基酸发生半胱氨酸/丝氨酸的突变。A3854G、C6004T、G15299A、G15682A 这4 个突变位点为本研究首次发现。今后还需对其扩大样本量或采取其他研究方法进行验证，并对其与肉质性状的相关性进行深入分析。

本研究主要针对CAPN1基因的全部外显子，对其内含子、5’-UTR 和3’-UTR 等区域尚未进行研究，今后将对这些区域多态性进行进一步的研究，并对其与肉质性状、胴体性状以及肌肉纤维等性状的相关性进行分析。

4 小结

本研究对早胜牛CAPN1基因的全部外显子多态性进行了分析，共检测到7 个多态性位点，其中3 个位点与前人的研究结果一致，且已有研究表明这些遗传变异与肉质嫩度、大理石花纹等性状相关，表明其可能作为肉品质相关候选基因的作用。其余4 个为本研究首次发现的位点，今后将对这些多态位点与经济性状的相关性进行进一步的研究分析。