甘草甜味素的化学成分研究

张航航,葛振红,李国柱,贾 旭,孟庆艳,2,*,刘文杰,2,*

(1.塔里木大学生命科学学院,新疆阿拉尔 843300;2.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆阿拉尔 843300;3.第一师阿拉尔市食品药品检验所,新疆阿拉尔 843300)

甘草甜味素是一类天然甜味剂,主要包括甘草酸、甘草素、甘草苷等化合物,甜度比蔗糖高50～300倍。甘草甜味素作为食品添加剂,具有溶解性好,低热量,耐热性好,溶血性低,安全无毒的特点,适合于高血压、糖尿病患者使用,并具有一定的医疗保健功效[1]。甘草甜味素能满足食品工业中对甜味剂的要求,在饮料中添加,可避免添加多糖引起的酸败、发酵等变化[2]。在口香糖中添加,对口腔具有抗炎清洁杀菌效果。高级香烟中添加可作为烟草的甜润,增香剂和保湿剂。甘草甜味素作为增香剂和风味增强剂,是天然绿色提取物,并赋予食品防病抗病的功能[3]。由于甘草甜味素具有亲水、亲油性,能与高级脂肪酸、甘油等日用化学品起乳化作用,因此甘草甜味素也被用做化妆品的功效成分,具有美白、抗炎、洗涤去污的作用[4]。甘草甜味素是一类混合物,必需明确其化学成分,为拓宽其应用提供理论基础。

天然产物研究中常用的分离纯化方法有柱色谱法、高速逆流色谱法等。但对于植物很多保留时间相近的化合物很难从复杂的体系中分离得到。因此,循环制备液相色谱是通过连续的循环操作方式实现模拟长柱的色谱分离效果,获得比传统长色谱柱更好的分离效率。循环制备液相色谱根据循环方式不同分为直接循环液相色谱、交替循环液相色谱、直接循环和交替循环相结合的制备液相色谱。直接循环由一根色谱柱和一个切换阀组成,通过控制阀的切换将溶剂和分离组分循环输入同一色谱柱中进行重复分离,来实现化合物的分离纯化。Sidana等[5]利用直接循环液相色谱分离出松三糖,其纯度达到94.7%。关颖丽等[6]利用双柱交替循环制备分离纯化朝鲜白头翁中三萜皂苷结构相似的化合物。李国柱等[7]利用直接循环和交替循环相结合的制备液相色谱从芳香新塔花中分离出结构相似化合物其纯度达到96.5%。本实验对甘草甜味素中的化学成分进行分离和结构鉴定。采用溶剂提取、中压制备液相色谱、制备液相色谱和循环柱色谱法对甘草甜味素进行分离纯化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘草甜味素 是生产甘草酸后的副产品,取自于新疆阿拉尔新农甘草产业有限责任公司;甲醇 色谱级,美国Sigma公司;超纯水系统 美国Millipore公司;甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯等 天津市致远化学试剂有限公司,均为分析纯试剂。

KQ-300DE 超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RE-2000B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;岛津LC-20AT型高效液相色谱仪(包括SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、LC-20AT泵、Lab Solutions 色谱工作站) 日本岛津公司;中压制备液相色谱系统 瑞士步琦有限公司;Waters制备液相色谱仪(Waters 2489紫外检测器,Waters 2545二元高压梯度泵)美国Waters公司;核磁共振仪500 MHz 瑞士bruker公司;STI 501 型液相色谱仪 杭州赛智科技有限公司;H-Class/Xevo TQD高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪(ESI源)美国Waters公司;Waters Xbridge C18(250 mm×19 mm,10 μm),2根;Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 实验方法

1.2.1 化学成分的提取 称取甘草甜味素200 g置于1 L的烧杯中,加入500 mL无水乙醇,用玻璃棒搅拌溶解保鲜膜封口放置过夜。将不溶于乙醇的物质置于干燥箱中烘干得馏分(A)150 g,将溶于乙醇的有机物旋干得馏分(B)50 g备用。称取馏分(A)20 g与硅藻土按1∶1的比例,置于研钵中拌匀,装入中压柱色谱系统,以甲醇-水(10∶90、30∶70、60∶40)和甲醇梯度洗脱,流速为15 mL/min,每段洗脱三个柱体积,将馏分(A)分为四段(Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd)。称取馏分(B)20 g,与硅藻土按1∶1的比例,置于研钵中拌匀,装入中压柱,以甲醇-水(10∶90、30∶70、60∶40、80∶20)和甲醇梯度洗脱,流速为15 mL/min,每段洗脱三个柱体积,分为五段(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe)。称取干燥的Ⅰa 10 g与硅藻土按1∶1的比例,置于研钵中拌匀,装入中压柱,以甲醇-水(5∶95、20∶80、50∶50)和甲醇梯度洗脱,流速为15 mL/min,将Ⅰa分为四段(Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅲd)。将各段馏分旋干后经HPLC检测,甘草甜味素的主要成分在Ⅰc段的分离度很低,运用循环制备分离。其他的主成分的分离度较好,利用高效液相制备色谱进行分离。

1.2.2 HPLC分离 利用高效液相制备色谱,以甲醇和水为流动相,粗提物Ⅱa、Ⅱc进行分离。流速为15 mL/min条件下分离。其他组分段中经HPLC检测,组分含量较少,并非是甘草甜味素中的主成分,因此,无需进行分离。化合物I为Ⅲa中组分,以色谱条件(0～20 min 10%甲醇)等度洗脱制备,得到化合物I(19 mg);化合物IV、V、VI、VII、VIII、IX、X为甲醇-水Ⅱc(60∶40)组分,以色谱条件(0～50 min 45%～70%甲醇;50～60 min 70%甲醇)梯度洗脱制备,分别得到化合物IV(33 mg),化合物V(15 mg);化合物VI(24 mg)、化合物VII(26 mg)、化合物VIII(14 mg)、化合物IX(132 mg)、化合物X(12 mg)。

1.2.3 循环HPLC分离 称取组分Ⅰc 150 mg,用3 mL蒸馏水溶解,配制成50 mg/mL样品备用。经循环HPLC(40%甲醇)制备得到化合物II(31 mg)、化合物III(39 mg)。

2 结果与分析

化合物I:白色针晶(甲醇),UV λmax:208,252 nm;ESI-MS m/z:137.0[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:7.73(2H,d,J=8 Hz),6.79(2H,d,J=12 Hz),7.71(1H,S),7.04(1H,S);其1H NMR 及13C NMR 数据(表1)与文献[8]报道基本一致,故鉴定化合物为对羟基苯甲酸(p-hydroxybenic acid)。

化合物II:白色针晶(甲醇),UV λmax:276,311 nm;ESI-MS m/z:579.2[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:2.70(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz),3.08(1H,dd,J=12.0,8.8 Hz),3.30-3.98(12H,m),4.97(1H,d,J=7.2 Hz),5.50(1H,d,J=12 Hz),5.53(1H,dd,J=12.0,3.0 Hz),6.36(1H,d,J=2.0 Hz),6.48(1H,dd,J=8.8,2.0 Hz),7.06(1H,d,J=8.0 Hz),7.48(1H,d,J=8.8 Hz),7.66(1H,d,J=8.8 Hz);其1H NMR 及13C NMR 数据(表1)与文献[9]报道基本一致,故鉴定化合物为甘草素-7,4′-二葡萄糖苷(Liquiritigenin-7,4′-diglucoside)。

表1 化合物I～X的碳谱数据(500 MHz,DMSO-d6,CD3OD,δ)Table 1 13C NMR Data of compounds I～X(500 MHz,DMSO-d6,CD3OD,δ)

化合物III:白色结晶(甲醇),UV λmax:276,311 nm;ESI-MS m/z:578.2[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:7.66(1H,d,J=3.6 Hz,H-5),7.40(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),7.05(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′,5′),6.53(1H,dd,J=1.2,7.6 Hz,H-6),5.50(1H,dd,J=2,10.8 Hz,H-2)5.36(IH,b.rs H-1),4.97(1H,d,J=7.2 Hz glc-H-1),3.17(1H,dd,J=8.8,10.4 Hz,H-3-trans),2.69(1H,dd,J=2.4,14.4 Hz,H-3-cis)。其1H NMR 及13C NMR 数据(表1)与文献[10]报道基本一致,故鉴定化合物为甘草素-4-O-芹糖基-(1→2)葡萄糖苷(liquiritigenin-apiosyl(1→2)glucoside)。

化合物IV:黄色粉末(甲醇),UV λmax:362 nm;ESI-MS m/z:549.2[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:5.06(1H,d,J=4 Hz,葡萄糖H-1),5.37(1H,d,J=1.6 Hz,芹糖H-1),6.28(1H,d,J=4 Hz,H-3′),6.42(1H,dd,J=4,4 Hz,H-5′),7.09(2H,d,J=8 Hz,H-3,5),7.79(1H,d,J=16 Hz,H-a),7.87(2H,d,J=8 Hz,H-2,6),7.89(1H,d,J=8 Hz,H-β),8.17(1H,d,J=8 Hz,H-6′)。其1H NMR 及13C NMR数据(表1)与文献[11]报道基本一致,故鉴定化合物为异甘草素葡萄糖芹菜苷(Licuraside)。

化合物V:黄色粉末(甲醇),UV λmax:361 nm;ESI-MS m/z:417.1[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:5.05(1H,d,J=8 Hz,芹糖H-1),6.26(IH,d,J=4 Hz,H-3,),6.41(IH,dd,J=8,4 Hz,H-5′),7.14(IH,d,J=8.8,4.0 Hz,H-3,5),7.79(IH,d,J=15.2 Hz,H-a),7.88(2H,dd,J=8.8,5 Hz,H-2,6),7.81(IH,d,J=8.8 Hz,H-β),5.13(IH,d,J=9.2 Hz,H-6′);其1H NMR 及13C NMR 数据(表1)与文献[11]报道基本一致,故鉴定化合物为异甘草苷(Isoliquiritin)。

化合物VI:无色针晶(甲醇),UV λmax:361 nm;ESI-MS m/z:254.9[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:2.66(1H,dd,J=4 Hz,H-3),3.12(1H,dd,J=16,4 Hz,H-3),5.45(1H,dd,J=0.8,0.8 Hz,H-2),6.35(1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.53(1H,dd,J=8.8,2.2 Hz,H-6),6.82(2H,d,J=8 Hz,H-3′,5′),7.34(2H,d,J=8.0 Hz,H-2,6),7.67(1H,d,J=8 Hz,5-H);其1H NMR及13C NMR 数据(表1)与文献[11]报道基本一致,故鉴定化合物为甘草素(Liquiritigenin)。

化合物VII:黄色粉末(甲醇),UV λmax:370 nm;ESI-MS m/z:254.9[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:7.75(1H,d,J=4 Hz,H-a),7.77(1H,d J=8 Hz,H-β),6.30(1H,d,J=4 Hz,H-3′),6.43(1H,dd,J=8.8,8 Hz,H-5′),8.18(1H,d,J=12 Hz,H-6′),7.77(2H,d,J=4 Hz,H-2,6),6.87(2H,d,J=12 Hz,H-3,5);其1H NMR 及13C NMR 数据(表1)与文献[12]报道基本一致,故鉴定化合物为异甘草素(Isoliquiritigenin)。

化合物VIII:白色针晶(甲醇),UV λmax:334 nm;ESI-MS m/z:267.2[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6)δH:3.79(3H,s,-OCH3),6.87(1H,d,J=8 Hz,H-8),6.95(1H,dd,J=8,4 Hz,H-6),7.0(2H,d,J=8 Hz,H-3′,5′),7.52(2H,d,J=8 Hz,H-2′,6′),7.97(1H,d,J=8 Hz,H-5),8.33(1H,s,H-2);其1H NMR 及13C NMR数据(表1)与文献[13]报道基本一致,故鉴定化合物为芒柄花素(Formononetin)。

化合物IX:白色粉末(甲醇);UV λmax(nm),247,271,311;ESI-MS m/z:417.2。[M-H]-1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δH:2.75(d,1 H,J=16.8 Hz,H-3,cis),3.05(dd,1H,J=12.7 Hz,H-3,trans),3.41～3.92(m,4 H,葡萄糖上的H),4.81(d,1H,J=7 Hz,葡萄糖H-1),5.44(dd,1 H,J=7 Hz,H-2),6.39(d,1 H,J=1.5 Hz,H-8),6.53(dd,1H,J=9 Hz,H-6),7.08(d,2H,J=9 Hz,H-3′,5′),7.38(d,2 H,J=9 Hz,H-2′,6′),7.75(d,1 H,J=9 Hz,H-5);其1H NMR及13C NMR数据(表1)与文献[14]报道基本一致,故鉴定化合物9为甘草苷。

化合物X:橙色粉末(甲醇);UV λmax(nm)247,314,369;ESI-MS m/z:269.3[M-H]-。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δH:3.35(s,3 H,-OCH3),3.90(dd,1 H,J=8.5,2.3 Hz,H-5),4.90(d,1 H,J=2.5 Hz,H-3),6.49(d,2 H,J=8.5 Hz,H-3′5′),6.82(d,1 H,J=15.8 Hz,H-α),7.65(d,2 H,J=8.5 Hz,H-2′,H-6′),8.03(d,1 H,J=15.8 Hz,H-β);其1H NMR及13C NMR 数据(表1)与文献[11]报道基本一致,故鉴定化合物10为刺甘草查耳酮。

3 结论

本实验以甘草甜味素作为研究对象,综合运用HPLC、中压制备色谱法、双柱交替循环制备柱色谱对甘草甜味素中的化学成分进行分离,得到10个单体化合物,用核磁共振仪对分离出的化合物进行鉴定,通过文献比较,确定10化合物分别是,对羟基苯甲酸(p-hydroxybenic acid)(I)、甘草素-7,4′-二葡萄糖苷(Liquiritigenin-7,4′-diglucoside)(II)、甘草素-4′-O-芹糖基-(1→2)葡萄糖苷(Liquiritigenin-apiosyl(1→2)glucoside))(III)、异甘草素葡萄糖芹菜苷(Licuraside)(IV)、异甘草苷(Isoliquiritin)(V)、甘草素(Liquiritigenin)(VI)、异甘草素(Isoliquiritigenin)(VII)、芒柄花素(Formononetin)(VIII)、甘草苷(Liquiritin)(IX)、刺甘草查尔酮(Echinatin)(X)。应用的双柱交替循环制备柱色谱技术具有分离效率高,节省溶剂等特点。本文明确了甘草甜味素中的化学成分,为评价其生物活性和应用前景提供了科学依据。