响应面法优化超声辅助提取荠菜多酚工艺及其抗氧活性研究

曹小燕,杨海涛

(1.陕西理工大学陕西省催化基础与应用重点实验室,陕西汉中 723000;2.陕西理工大学化学与环境科学学院,陕西汉中 723000)

荠菜(Capsellabursa-pastoris.)是十字花科植物,在我国分布广泛[1]。荠菜作为一种药食同源植物,富含黄酮[2]、多糖[3]、生物碱[4]、氨基酸[5]、微量元素[6]、多酚[7]等多种活性成分,其中多酚是广泛分布于植物体内的多元酚类次生代谢产物,具有抗氧化活性、抑菌、抗肿瘤、降血糖和调节血脂等多种生物活性[8-9]。植物多酚的提取与分离研究,可为天然抗氧化剂和多酚保健食品的开发提供原料。目前,国内外学者对植物多酚的提取技术已有较多的研究如溶剂浸提法[10]、微波提取[11]、超声波辅助提取法[12]、酶辅助提取法[13]、超临界流体萃取法[14]等,其中超声波辅助提取法具有提取时间短、效率高、成本低和降低高温对提取物的影响等优点[15],但利用此法提取荠菜多酚的研究目前鲜见报道。

本研究以野生荠菜为原料,在单因素实验的基础上结合响应面分析试验优化了荠菜多酚的提取工艺;借助体外抗氧化模型,评价了荠菜多酚的自由基清除活性,为荠菜多酚功能性食品和保健品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荠菜 2017年3～5月采摘于汉中连城山;没食子酸、Folin-Ciocalteu试剂、抗坏血酸、硫酸亚铁 阿拉丁试剂;其他试剂 均为国产分析纯,南京化学试剂有限公司。

EL104型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;Cary50紫外可见分光光度计 美国瓦里安中国有限公司;WGL-125B型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;SB-4200DTD型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;FW100高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;RE-2A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;JXL-2S-6A数显恒温水浴锅 江苏省金坛市金祥龙电子有限公司;SHB-Ⅲ循环水式真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荠菜预处理及多酚的提取工艺 采集开花期荠菜全草,除杂后样品分为四份(根、叶、花和全草)置于50 ℃烘箱中烘干至恒重,粉碎后过60目筛于4倍体积的石油醚中脱脂,烘干备用。准确称取一定量的脱脂样品于50 mL锥形瓶中,加入一定体积的提取溶剂在一定的超声温度和功率条件下,超声辅助提取一定的时间,于2500 r/min离心机中离心10 min,得到荠菜多酚的提取液,旋转蒸发仪减压浓缩提取液,蒸馏水定容于一定体积的容量瓶中,得到荠菜多酚的待测液。

1.2.2 单因素实验 固定提取时间30 min,提取温度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超声功率280 W,提取溶剂为甲醇50%、乙醇50%、乙酸乙酯50%、正己烷50%和水,考察不同提取溶剂对荠菜多酚提取量的影响;固定提取溶剂为乙醇,提取时间30 min,提取温度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超声功率280 W,乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%,考察乙醇浓度对荠菜多酚提取量的影响;固定乙醇浓度50%,提取温度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超声功率280 W,提取时间为10、20、30、40、50 min,考察提取时间对荠菜多酚提取量的影响;固定乙醇浓度50%,提取时间30 min,料液比1∶30 (g∶mL),超声功率280 W,提取温度为40、50、60、70、80 ℃,考察提取温度对荠菜多酚提取量的影响;固定乙醇浓度50%,提取时间30 min,提取温度40 ℃,超声功率280 W,料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g∶mL),考察料液比对荠菜多酚提取量的影响;固定乙醇浓度50%,提取时间30 min,提取温度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超声功率为240、280、320、360、400 W,考察超声功率对荠菜多酚提取量的影响。

1.2.3 响应面试验 以荠菜多酚的提取量为评价指标,结合单因素的实验结果,采用Box-Behnken中心组合试验设计的原理,以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度四个因素,设计四因素三水平的响应面分析试验[16],优化超声辅助提取荠菜多酚的提取工艺。响应面分析因素与水平见表1。

表1 响应面实验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 多酚含量的测定

1.2.4.1 绘制没食子酸标准曲线 参考郭彩霞等[17]实验方法稍作修改。精确配制1 mg/mL的没食子酸母液,依次配制成质量浓度为0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055 mg/mL的标准溶液。于10 mL离心管中加入上述标准溶液1 mL,0.1 mg/mL福林酚试剂5 mL,摇匀后反应6 min。加入75 mg/mL Na2CO3溶液4 mL,避光静置60 min,以蒸馏水做空白对照,于756 nm波长下检测其吸光度值。以没食子酸浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程为:y=151.57x+0.0271(R2=0.9998),用于评价荠菜多酚的质量浓度。

1.2.4.2 荠菜多酚的提取量测定 依据标准曲线的绘制方法,测定待测液中荠菜多酚的质量浓度,依据下列公式,计算荠菜多酚的提取量。

K=a×b/m

式中,K为荠菜多酚的提取量,用mg/g表示;a是荠菜提取液中的多酚质量浓度(mg/mL);b为待测液体积(mL);m为所称取荠菜样品的质量(g)。

1.3 统计分析

所有数据均为测定三次、取平均值,采用Origin 7.5软件进行统计分析,结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取溶剂对荠菜多酚提取量的影响 由图1可知,5种提取溶剂对荠菜多酚提取量的影响次序为乙醇>丙酮>甲醇>乙酸乙酯>水,其中乙醇所得的多酚提取量最高为(21.93±0.15) mg/g,故提取溶剂选择乙醇。

图1 不同提取溶剂对荠菜多酚提取量的影响Fig.1 Effects of different extraction solvents on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.2 乙醇浓度对荠菜多酚提取量的影响 由图2可知,荠菜多酚的提取量随乙醇浓度的增加而增加(30%～50%),50%时达到峰值。当乙醇浓度增大时,降低了溶剂体系的极性,更容易破坏植物体内多酚类物质与多糖、蛋白质等物质间的氢键,促使多酚类物质的溶出增加;继续增加乙醇浓度达到最大值时,溶剂极性较弱,增加了荠菜中的醇溶性物质与多酚的竞争性溶出[22]。故乙醇浓度选择50%。

图2 乙醇浓度对荠菜多酚提取量的影响Fig.2 Effects of ethanol concentration on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.3 提取时间对荠菜多酚提取量的影响 由图3可知,在10～30 min范围内,随着提取时间的延长,荠菜多酚的提取量快速增加,30 min时达到最大值。随着提取时间的增加,荠菜中的多酚类物质慢慢溶出,30 min时多酚的溶出完全,进一步延长提取时间,由于超声波的空化作用、机械效应促使多酚类物质发生氧化、聚合等副反应[23],促使提取量降低。因此选择超声时间30 min为宜。

图3 提取时间对荠菜多酚提取量的影响Fig.3 Effects of extract time on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.4 提取温度对荠菜多酚提取量的影响 由图4可知,在40～60 ℃范围内,随提取温度的升高,荠菜多酚的提取量快速增加,提取温度60 ℃时达到峰值。当提取温度升高时,促使提取体系内分子的平均动能增加,多酚类物质间的传质增多,从而增加了多酚的提取量,当提取温度过高时,高温会引起多酚类物质的氧化而破坏[24]。故选取60 ℃为较佳的提取温度。

图4 提取温度对荠菜多酚提取量的影响Fig.4 Effects of extract temperature on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.5 料液比对荠菜多酚提取量的影响 由图5可知,在液料比1∶10～1∶30 (g∶mL)范围内,随着料液比的变化,荠菜多酚的提取量快速增加,1∶30 (g∶mL)时达到最大值。随着溶剂的增多,增加了荠菜中多酚类物质与溶剂的浓度差,促使了多酚类物质的溶出;当体系中的溶剂量过多时,使得多酚类物质在后处理浓缩过程中的损失增加[25]。故料液比选择为1∶30 (g∶mL)。

图5 料液比对荠菜多酚提取量的影响Fig.5 Effects of material-liquid ratio on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.6 超声功率对荠菜多酚提取量的影响 由图6可知,当超声功率在240～280 W时,荠菜多酚的提取量随超声功率的增大而增加,280 W时多酚的提取量达到峰值。继续加大超声功率,多酚的提取量缓慢降低,因为在高超声功率作用下,多酚类的物质成分遭到破坏,从而多酚提取量降低,故在后续实验中固定超声功率为280 W。

图6 超声功率对荠菜多酚提取量的影响Fig.6 Effects of ultrasonic power on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面模型的建立与分析 根据Box-Benhnken实验设计进行实验,得到了27组荠菜多酚的提取量如表2所示,并利用Design Expert 8.05软件对所得到的27组数据进行响应面分析得方差分析结果见表3。对表2的实验结果进行分析,得到荠菜多酚的提取量(Y)为响应值,乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)和提取温度(D)为自变量的四元二次回归模型为:

表2 响应面分析实验的设计及结果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

Y=-65.03625+0.37617A+2.61217B-1.27100C+2.08833D+0.014125AB+0.016325AC+9.62500E-003AD-5.7500E-004BC-0.021325BD+0.015575CD-0.018763A2-0.031513B2-6.93750E-003C2-0.020337D2

表3 响应面的方差分析结果Table 3 Variance analysis result of regression surface analysis

2.2.2 验证实验 通过分析响应面试验模型,预测得到荠菜多酚提取量的最大响应值为Y=28.35 mg/g,即乙醇浓度为48.11%、料液比为1∶33.11 (g∶mL)、提取时间为27.40 min,提取温度为56.84 ℃,为了便于实际操作,设定乙醇浓度为48%,料液比1∶33 (g∶mL)、提取时间为27 min,提取温度为57 ℃,平行三次实验得到荠菜多酚提取量的平均值为28.33 mg/g,与模型预测值28.35 mg/g相比,其相对误差为0.07%。以此最佳条件,评价荠菜不同部位的多酚提取量见表4。由表4可以看出,不同部位的荠菜多酚提取量不同,其多酚含量由高到低的顺序为:荠菜叶>全草>花>根。其中人们常吃的荠菜叶中的多酚提取量最高,为充分开发功能性荠菜食品提供一定的实验依据。

表4 不同部位荠菜多酚提取量的测定结果Table 4 Determination results of polyphenol extraction yield in different parts of Capsella bursa-pastoris

2.3 荠菜多酚的体外抗氧化活性分析

2.3.1 荠菜多酚对羟基自由基(·OH)的清除能力 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法评价了荠菜多酚清除·OH的能力。由图7可知,荠菜多酚具有明显的清除·OH的能力,但清除活性弱于同浓度条件下的VC溶液。当样品浓度为0.21 mg/mL时,VC溶液对·OH的清除率高达80.82%±0.40%,其清除IC50值为(0.08±0.01) mg/mL;而同浓度条件下荠菜多酚提取液的清除率为61.32%±0.45%,其清除IC50值为(0.17±0.01) mg/mL,说明荠菜多酚对·OH具有较强的清除能力。

图7 荠菜多酚与VC对·OH清除活性Fig.7 Scavenging ·OH activity ofCapsella bursa-pastoris polyphenols and VC

图8 荠菜多酚与VC对清除活性Fig.8 Scavenging activity ofCapsella bursa-pastoris polyphenols and VC

2.3.3 荠菜多酚对亚硝酸盐(NaNO2)清除能力 在弱酸性条件下,亚硝酸盐和对氨基苯磺酸能发生重氮化反应,再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色化合物,通过测定540 nm处吸光度值的变化,得到反应液中亚硝酸钠的含量。由图9可知,在所测定的实验浓度范围内,荠菜多酚和VC溶液对亚硝基的清除率均随其浓度的增加而增加。荠菜中的多酚提取物具有明显的清除亚硝酸盐能力,但其清除效果弱于同浓度条件下的VC溶液。在浓度为42 μg/mL时,VC溶液对亚硝基的清除率78.76%±1.27%,其清除IC50值为(16.2±0.01) μg/mL;而荠菜多酚提取液的清除率为75.05%±1.23%,其清除IC50值为(18.9±0.02) μg/mL。表明荠菜多酚具有一定的清除亚硝酸盐活性。

图9 荠菜多酚与VC对NaNO2清除活性Fig.9 Scavenging NaNO2 activity ofCapsella bursa-pastoris polyphenols and VC

2.3.4 荠菜多酚的还原能力 由图10可知,在测定的质量浓度范围内,荠菜多酚的还原力随着质量浓度的升高而增强且量效关系显著,但弱于同浓度条件下VC溶液的还原能力。实验结果表明荠菜多酚具有一定的还原能力,证明荠菜多酚提取液是一种良好的自由基清除剂,具有一定的抗氧化活性。

图10 荠菜多酚和VC的还原能力Fig.10 Reduction ability of Capsellabursa-pastoris polyphenols and VC

3 结论

荠菜多酚提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度为48%,超声提取时间为27 min,提取温度为57 ℃,料液比为1∶33 (g∶mL),得到荠菜多酚的提取量为(28.33±0.08) mg/g。在此最佳工艺条件下,测定了荠菜叶、花、根的多酚提取量分别为(30.95±0.04)、(27.52±0.14)、(20.42±0.03) mg/g。

本研究不足之处在于对荠菜多酚的抗氧化评价为体外活性评价模型,下一步应采用细胞或小鼠等体内模型评价其抗氧化性,为其生理学活性的合理解释提供实验依据。