鹅皮胶原蛋白/壳聚糖复合膜理化性质和保鲜效果

阮一凡，朱静静，潘道东,2,*，孙杨赢，沈建良

（1.宁波大学 浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315211；2.南京师范大学金陵女子学院食品科学与营养系，江苏 南京 210097；3.湖州展旺食品科技有限公司，浙江 湖州 313014）

随着生活水平的提高，人们对食品品质及安全性的要求也越来越高，加上大众的环保意识不断增强，人们越来越青睐选择用天然性生物材料包装的食品[1]。其中胶原蛋白作为一种主要存在于皮肤和动物结缔组织的功能性蛋白，其分布广泛、易得、便宜、无毒，并且研究发现，胶原蛋白的水解产物胶原蛋白肽具有免疫调节、抗血压、抗血栓、抗氧化、抑菌、抗癌、促进吸收等诸多生物活性[2]。因此，胶原蛋白成为近年来天然性生物材料研究的热点。但是单一的胶原蛋白膜的拉伸强度弱、易吸水，使得其很难广泛用于食品包装。有许多方法用于解决这一难题，如化学交联、酶交联和复合其他的聚合物等。壳聚糖是自然界中现发现的唯一一种碱性多糖，它具有无毒、抗菌性及成膜性好等特性，能够与多种聚合物如甲基纤维素、淀粉和明胶很好地复合，并且复合物具有改善复合膜理化性质的功效[3-4]。研究表明添加壳聚糖能够很好地改善明胶膜理化性质，主要是因为明胶和壳聚糖能够通过静电作用和氢键相互反应[5]。然而，明胶作为源胶原蛋白的水解产物，都是主要由（Gly-X-Y）n的氨基酸序列组成，其中X、Y代表任何氨基酸，但是代表脯氨酸和羟脯氨酸的频率最高，并且明胶在成膜的过程中会复原胶原蛋白的三维螺旋结构[6]；但壳聚糖的添加是否也能够改善胶原蛋白膜的理化性质还不清楚。

我国是养鹅大国，其年出栏量约占世界的80%，并且每年鹅养殖量总体呈现上涨的趋势。浙东白鹅作为地方优势品种，在浙江地区广范养殖。鹅皮中含有丰富的胶原蛋白，胶原蛋白经水解后可形成具有多种生物活性的胶原蛋白肽，而抗氧化性是胶原蛋白肽重要的功能活性之一。但通常情况下鹅皮等副产物加工利用率低[7]，基于此，本课题从新鲜鹅皮中提取胶原蛋白进行研究。

利用胶原蛋白和壳聚糖制成的胶原蛋白/壳聚糖可食性复合膜相较于单一的胶原蛋白膜，壳聚糖的添加可能改善胶原蛋白膜的机械性能、阻隔性及抑菌保鲜性[8]。为了验证这一想法以及提高鹅皮等副产品的利用率，同时也为给由天然生物材料制成安全、无毒且具有抗氧化效果的可食性复合膜的研发提供理论参考，本实验利用前期制备的鹅皮胶原蛋白与壳聚糖复合制备鹅皮胶原蛋白/壳聚糖可食性复合膜，研究胶原蛋白/壳聚糖不同配比对膜水蒸气透过率、透光率以及机械性能的影响，并用制备的复合膜涂抹于新鲜鸭肉表面，对鸭肉进行感官评定、菌落总数、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值及挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量的测定来研究复合膜对肉品的保鲜效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸭肉购于宁波大学农贸市场。

壳聚糖（脱乙酰度95%） 武汉万荣科技发展有限公司；胃蛋白酶 北京索莱宝公司。

1.2 仪器与设备

150 mm×25 mm PE培养皿 美国CORNING公司；DHG-9108A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；HD2025W型电动搅拌机 上海司乐仪器有限公司；Spectar Max 190酶标仪 美国Molecular Devices公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司；Jipad-20拍打式无菌均质器上海旌派仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；QHZ-12B组合式全温振荡培养箱金坛市国旺实验仪器厂；5569A型材料万能试验机美国Instron公司。

1.3 方法

1.3.1 鹅皮胶原蛋白的提取

胶原蛋白提取参考Woo等[9]的方法，并稍作修改。将浙东白鹅宰杀后，取鹅皮除去其可见脂肪，然后剪碎鹅皮，处理后的鹅皮用其2～3 倍体积的乙醚（纯度≥99%）浸泡12 h以上，进一步除去鹅皮脂肪，再用5 倍体积的0.1 mol/L NaOH溶液浸泡6 h除去杂蛋白，离心后取上清液，将所得上清液用浓HCl调pH值至2后，用原鹅皮质量2%的胃蛋白酶（pH 2.0）于4 ℃酶解72 h。酶解完成后收集酶解产物并冷冻干燥，得胶原蛋白。

1.3.2 膜液制备

蒸馏水中加入一定量的胶原蛋白制成质量浓度为30 g/L的胶原蛋白溶液；将壳聚糖溶于体积分数2%的醋酸溶液中，制成质量浓度为30 g/L的壳聚糖溶液。将胶原蛋白、壳聚糖2 种溶液依次按10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8，0∶10的体积比混合，电动搅拌机搅拌混匀，4 ℃静置过夜脱除气泡。将膜液均匀地铺展在聚乙烯塑料盘中，放入50 ℃的恒温鼓风干燥箱中，干燥5 h后取出，冷却揭膜，得到不同比例的胶原蛋白/壳聚糖复合膜。将制备好的膜放在25 ℃、相对湿度为50%的恒温恒湿箱中平衡2 d后保存在干燥器中备用[10]。

1.3.3 水蒸气透过率的测定

在室温条件下，向25 mm×40 mm的称量瓶中加入15 mL蒸馏水，剪取光滑平整的膜样，经螺旋测微器测量其厚度后，用融化的石蜡将膜紧密覆盖在称量瓶口上，迅速称质量。称质量结束后放入干燥器内，干燥器底部放一定量的变色硅胶干燥剂，使膜内外两侧保持一定的蒸汽压差，25 ℃条件下每隔3 h称质量1 次，共称量3 次。按式（1）计算复合膜的水蒸气透过率。

式中：q/t为单位时间内称量瓶质量增加量/（g/h）；d为复合膜的厚度/mm；S为水蒸气透过有效膜的面积/m2；ΔP为膜两侧水蒸气的压强差（3.168 kPa）。

1.3.4 透光率的测定

透光率的测定参考文献[11]。将待测样品剪成大小为20 mm×50 mm的矩形，用胶带固定在96 孔板表面，用酶标仪测定500 nm波长处的吸光度，以空白孔作对照。透光率按式（2）计算。

式中：A500nm为样品在500 nm波长处的吸光度。

1.3.5 膜厚度、抗拉强度和断裂伸长率测定

在膜上随机选取5 个点，用千分尺测其厚度，计算平均值。

选择光滑平整的膜样品，裁成15 mm×50 mm的长条，用材料万能试验机对其抗拉强度与断裂伸长率进行测定。测试仪的初始夹距设定为40 mm，拉伸速率设置为10 mm/min，按式（3）、（4）分别计算膜的抗拉强度、断裂伸长率。

式中：Fmax为膜断裂时所承受的最大拉力/N；S为测试样品有效面积/mm2。

式中：L0为样品拉伸前的有效长度/mm；L1为样品拉伸断裂时的长度/mm。

1.3.6 复合膜的肉品保鲜性能测定

在无菌条件下，将新鲜鸭肉进行均匀分割处理，并随机分组，实验组分别浸入不同胶原蛋白、壳聚糖配比的保鲜膜液中1 min，取出，晾干；以灭菌后的生理盐水处理为对照组。每组重复3次，然后分别装入保鲜袋中，于（4±1）℃条件下贮藏。在冷藏过程中的第0、3、6、9、12天各取样一次，对鸭肉进行感官评价，并测定肉品中菌落总数、TBA值以及TVB-N含量。

1.3.6.1 感官评价

参考郑梦林等[12]的方法进行感官评定，略作修改，以肉的色泽、气味、组织形态和保水性作为4 个评价指标，由经过感官评定培训后的8 位同学组成评定小组对其评分，按10 分制评分，最后取平均值，具体评分标准见表1。

表1 感官评分标准Table1 Criteria for sensory evaluation of duck

1.3.6.2 菌落总数的测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[13]进行细菌总数的测定。具体方法为：用225 mL生理盐水稀释25 g鸭肉样品制成1∶9（m/m）的样品匀浆液，吸取样品匀浆液1 mL，加入到盛有9 mL生理盐水的无菌试管中制成1∶9（V/V）的样品匀浆液。按上述操作，制备10 倍系列稀释梯度样品匀浆液。培养基为平板计数琼脂。

1.3.6.3 TBA值的测定

TBA值的测定参照黄鸿兵等[14]的方法。取10 g碎肉加25 mL体积分数25%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，加20 mL蒸馏水，高速均质30 s，3 000 r/min离心20 min，中速滤纸过滤，取2 mL上清液，加入2 mL 0.02 mol/L TBA，沸水浴20 min，流水冷却5 min，用酶标仪于532 nm波长处测定吸光度，空白为1 mL TCA溶液（体积分数25%）、1 mL蒸馏水、2 mL 0.02 mol/L TBA的混合液，丙二醛含量以1,1,3,4-四乙氧基丙烷标定后折算。TBA值以每千克碎肉中所含丙二醛的质量表示。

1.3.6.4 TVB-N含量的测定

参考GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》[15]的方法对各组鸭肉样品中的TVB-N含量进行测定，TVB-N含量小于15 mg/100 g为一级鲜度，含量在15～20 mg/100 g之间为二级鲜度，大于20 mg/100 g为变质肉。

1.4 数据处理

使用SAS 8.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白/壳聚糖配比对复合膜水蒸气透过率的影响

图1 胶原蛋白/壳聚糖配比对复合膜水蒸气透过率的影响Fig.1 Effect of collagen to chitosan ratio on WVP of composite membranes

水蒸气透过率是表征薄膜对水分阻隔效果的重要指标[16]。不同胶原蛋白/壳聚糖配比对膜水蒸气透过率的影响如图1所示。纯胶原蛋白膜的水蒸气透过率为0.70（g·mm）/（m2·h·kPa），随着胶原蛋白的添加量增加，胶原蛋白/壳聚糖复合膜的水蒸气透过率显著降低。V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＜6∶4后，水蒸气透过率趋于稳定，此比例下制备的胶原蛋白/壳聚糖膜如图2所示。胶原蛋白为亲水性的蛋白质，其膜阻湿性较差，易受环境湿度的影响，壳聚糖的加入能够降低复合膜的水蒸气透过率。

图2 胶原蛋白/壳聚糖（体积比6∶4）复合膜外观Table2 Visual appearance of composite membranes with collagen to chitosan ratio of 6∶4 （V/V）

2.2 胶原蛋白/壳聚糖配比对复合膜透光率的影响

胶原蛋白及壳聚糖这两种物质相容性的优劣能够通过测定膜的透光率来进行判断[17]。不同配比的胶原蛋白/壳聚糖对膜透光率的影响如图3所示。在500 nm波长处，不同配比复合膜的透光率均在70%以上，且最低值与最高值的差值小于9%，说明胶原蛋白和壳聚糖的相容性较好，将两者混合所制备的复合膜具有良好的透光性。

图3 胶原蛋白/壳聚糖配比对复合膜透光率的影响Fig.3 Effect of collagen to chitosan ratio on light transmittance of composite membranes

2.3 胶原蛋白/壳聚糖配比对复合膜机械性能的影响

不同复合膜的厚度、抗拉强度及断裂伸长率的测定结果见表2。所有处理组膜的厚度没有显著差异（P＞0.05）。纯胶原蛋白膜的抗拉强度与断裂伸长率分别为6.64 MPa和11.99%，复合膜的抗拉强度及断裂伸长率与纯胶原蛋白膜相比均明显提高，说明加入的壳聚糖改善了复合膜的机械性能，这可能与两者之间会产生静电吸引作用、较强的氢键交联作用和分子水平上共混性较好有关[18]。当V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＞6∶4时，膜的抗拉强度随着壳聚糖添加量的增加而增大；在V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝6∶4时，复合膜抗拉强度最大（36.05 MPa）；当V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＜6∶4时，膜的抗拉强度与壳聚糖的添加量成反比，这可能是因为壳聚糖含量太多，不能充分地与胶原蛋白之间形成分子间作用力。此外，复合膜的断裂伸长率随壳聚糖添加量的增多而不断增大，这可能与壳聚糖含较多的—NH2、—OH等极性基团相关，在相同湿度下，随壳聚糖添加量增加，复合膜的吸湿率增大，而水的增塑作用提高了复合膜分子链段的运动性，进而增强了复合膜的断裂伸长率[19-20]。

表2 胶原蛋白/壳聚糖配比对复合膜机械性能的影响Table2 Effect of collagen to chitosan ratio on mechanical properties of composite membranes

2.4 复合涂膜对鸭肉感官品质的影响

贮藏期间内，不同处理组鸭肉的感官评定结果见表3。可以看出，随着贮藏时间的延长，各处理组的感官评分均呈下降趋势，且各处理组的感官评分均高于对照组。第12天时，对照组肉品异味显著，呈暗褐色无弹性，丧失食用价值。在贮藏期间内，各处理组的可接受度均优于对照组。

表3 不同处理组鸭肉综合感官评分结果Table3 Sensory evaluation of duck samplescoated with different composite membranes

2.5 复合涂膜对鸭肉菌落总数的影响

菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价[21]。根据卫生标准[22]：一级鲜肉，菌落总数不大于104CFU/g；二级鲜肉，菌落总数不大于106CFU/g；三级鲜肉，菌落总数不大于107CFU/g；腐败肉，菌落总数大于108CFU/g。

利用不同胶原蛋白/壳聚糖配比的复合膜对新鲜鸭肉进行涂膜处理，不同处理组的菌落总数测定结果见表4。在贮藏期间内，各处理组的菌落总数含量均呈现上升趋势。在第0天，新鲜鸭肉的菌落总数为4.20（lg（CFU/g）），之后在整个贮藏期间，除了纯胶原蛋白和壳聚糖涂膜组外，其他涂膜处理组的菌落总数均显著低于对照组（P＜0.05），说明复合涂膜在一定程度上能够阻隔微生物的附着。第12天时，对照组的菌落总数达到了7.60（lg（CFU/g）），已经超过了卫生标准三级鲜肉的菌落总数限量，这与许立兴等[23]的研究结果相似。而在第12天，除纯胶原蛋白涂膜处理组外，其他处理组均在鲜度范围内，考虑到是因为胶原蛋白的亲水性，导致其成膜性差，抑菌效果不明显。贮藏的前6 d，不同胶原蛋白/壳聚糖配比对菌落总数的影响不大；贮藏6 d后，不同配比对于菌落总数的影响较明显，且V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝4∶6涂膜组菌落生长最为缓慢，此时菌落总数为4.75（lg（CFU/g））；V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝6∶4组次之，为5.49（lg（CFU/g））。结果表明胶原蛋白/壳聚糖复合涂膜明显降低了鸭肉贮藏过程中的菌落总数，提高了肉品品质。

表1 复合涂膜对鸭肉贮藏过程中菌落总数的影响Table1 Effect of composite coatings on total bacterial count in duck during storagelg（CFU/g）

2.6 复合涂膜对鸭肉TBA值的影响

TBA值作为脂类氧化的重要指标，是评价肉制品中脂类氧化的常用方法。TBA值越大，脂肪氧化的程度就越高，产生的小分子物质如酮、醛、酸类等就会越多，因而产品的腐败也就会越严重[24]。据报道，TBA值达到1～2 mg/kg以上就已腐败变质[25]。

从表5中可以看出，随着贮藏时间的延长，TBA值呈现逐渐上升的趋势。贮藏前3 d，相较于纯胶原蛋白和壳聚糖涂膜组，复合涂膜组TBA值均上升缓慢，说明从贮藏3 d开始对照组鸭肉中的脂肪被迅速氧化，而胶原蛋白/壳聚糖复合涂膜组氧化速度依然较慢。从菌落总数的结果得知，在第12天对照组鸭肉已经超过腐败标准，与感官评价结果也相符；但此时对照组鸭肉的TBA值并没有超标，这可能是由于脂肪氧化产生的MDA还能与蛋白质、氨基酸、以及脂肪氧化的醛类反应。结果分析表明TBA值可能不是直接反映鸭肉鲜度的因素，或者可能是TBA值不能作为衡量鸭肉氧化程度的参考指标[26]。但是V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝8∶2和V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝6∶4组TBA值增长趋势相较于其他组明显缓慢；而随着时间的延长，V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝6∶4抑制效果更加明显，在贮藏12 d时TBA值最低，为0.35 mg/kg。

表5 复合涂膜对鸭肉贮藏过程中TBA值的影响Table5 Effect of composite coatings on TBA value in duck during storage mg/kg

2.7 复合涂膜对鸭肉中TVB-N含量的影响

TVB-N含量能够反映肉品的新鲜度。肉中的氨基酸及蛋白质含量高，在内源酶与细菌的作用下能够分解为氨和低级胺类等碱性含氮物质。利用不同胶原蛋白/壳聚糖配比的复合膜对新鲜鸭肉进行涂膜处理，不同处理组的TVB-N含量测定结果见表6。在贮藏期间内，各处理组的TVB-N含量均呈现上升趋势。在第0天，新鲜鸭肉的TVB-N含量为2.84 mg/100 g，贮藏时间超过3 d后，涂膜组的TVB-N含量均显著低于对照组（P＜0.05），说明涂膜在一定程度上阻隔了微生物的附着。贮藏第12天时，V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝6∶4组TVB-N含量最低，为18.04 mg/100 g，而此时对照组的TVB-N含量达到了23.30 mg/100 g，超过国家标准要求的鲜肉TVB-N含量，而除纯胶原蛋白涂膜处理组外，其他处理组均在鲜度范围内，不同胶原蛋白/壳聚糖配比对TVB-N含量的影响不明显。结果表明胶原蛋白/壳聚糖复合涂膜明显降低了鸭肉贮藏过程中的TVB-N含量，提高了肉品品质。

表6 复合涂膜对鸭肉贮藏过程中TVB-N含量的影响Table6 Effect of composite membranes on TVB-N content of duck during storage mg/100 g

3 讨 论

本研究将鹅皮胶原蛋白与壳聚糖共混，以改善纯胶原蛋白膜和纯壳聚糖膜的性能。通过溶液共混制备了不同体积比胶原蛋白/壳聚糖复合膜，当V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＞6∶4时，随壳聚糖含量增加复合膜水蒸气透过率明显降低，当V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＜6∶4后，复合膜水蒸气透过率无明显变化，说明壳聚糖的加入能够降低复合膜的水蒸气透过率。复合膜的透光率随壳聚糖添加量的增加而略有增加，但变化不大，说明胶原蛋白和壳聚糖具有良好的相容性。断裂伸长率随着壳聚糖添加量增多而增大，说明加入的壳聚糖改善了复合膜的机械性能。而复合膜的拉伸强度随着壳聚糖添加量的增加呈先增加后减少的趋势，当V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝6∶4时，膜的拉伸强度最大，为36.05 MPa，此时复合膜具备良好的水蒸气透过率、透光率和断裂伸长率等性能。利用胶原蛋白/壳聚糖复合膜对新鲜鸭肉进行涂膜处理，结果显示，相较于对照，涂膜处理都显著降低了鸭肉贮藏过程中菌落总数（除纯胶原蛋白、GH涂膜组）、TBA值和TVB-N含量（P＜0.05），提高了肉品的品质，且V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝6∶4和V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝4∶6组保鲜效果较其他组更好。综上所述，当V（胶原蛋白）∶V（壳聚糖）＝6∶4时制备的复合膜最优。

胶原蛋白和壳聚糖的复合膜在很多领域都有被充分利用，多见于生物领域、常被用于伤口敷料，具有良好的凝血特性、细胞相容性和抗菌性[27-28]，同时成为了具有增强生物稳定性和良好生物相容性的皮肤等价物的潜在候选物[29]。而在食品保鲜中，Ahmad等[30]评估应用于食品包装的胶原蛋白/壳聚糖和胶原蛋白/大豆蛋白分离物（soy protein isolate，SPI）复合膜的潜力，制备了使用质量分数30%甘油作为增塑剂的胶原蛋白/壳聚糖、胶原蛋白/SPI不同混合比的两种复合膜，结果表明与胶原蛋白膜相比，胶原蛋白/壳聚糖和胶原蛋白/SPI复合膜都不同程度地改善了机械性能，且两种复合膜具有较低的透光率，都比胶原蛋白膜略微粗糙，但没有明显的裂纹迹象和分层现象，表现出复合膜作为可生物降解的包装材料的潜力。于林等[31]用茶多酚改性白鲢鱼鳞中的胶原蛋白，与壳聚糖形成的复合膜对冷藏斜带石斑鱼的保鲜，结果表明茶多酚改性的复合膜能够有效抑制鱼肉中微生物的滋长，抑制蛋白质的变性，延长斜带石斑鱼的货架期，且效果优于未改性的复合膜的保鲜效果。陈达佳等[32-34]发现脂肪酸、阿魏酸和茶多酚改性鮰鱼皮中的胶原蛋白，与壳聚糖形成的可食用复合膜都有一定的包装功能，能够部分起到替代塑料包装的效果。

胶原蛋白由于其生物相容性而常用于组织工程，同时它还具有机械强度低和降解速率不可预测的优点。目前胶原蛋白的主要来源是畜禽动物组织，由于从牛、猪等哺乳动物中衍生胶原蛋白成本高、朊病毒传播风险大，且相关疾病如牛海绵状脑病、口蹄疫的爆发，人们对从牛、猪等中提取出的胶原蛋白的安全性提出了质疑，促使现在对于替代此种胶原蛋白来源的研究更加广泛[35]。相对牛、猪等动物来源的胶原，鹅皮胶原蛋白及多肽安全性更高，而且我国是养鹅大国，在屠宰过程中产生的鹅皮等副产品并没有得到合理利用，造成了大量的浪费。现如今，许多科研工作者已成功从鱼皮、猪皮、牛皮等动物皮中提取出胶原蛋白及其多肽，而从鹅皮中提取胶原蛋白的研究很少。在过去，生鹅皮常用来制作鹅裘皮，但随着制革行业对于鹅皮的需求量减少，越来越多的鹅皮被直接丢弃，既极大浪费了生物资源，又污染环境；鹅皮中胶原成分介于表皮和脂肪层之间，厚度约占皮张总厚度的1/35～1/20，经过适当脱脂处理，鹅皮能够成为良好的胶原蛋白来源[36]。

综上所述，本实验得到了一种各项性能较好且具有很好保鲜效果的复合膜，基于复合膜特殊的性能，有望成为一种潜在的食品内包装膜。而随着人们对养鹅产业逐渐深入地认识，若能同时进行高附加值产品的开发利用，这样既可以减少资源的流失和环境的污染，也可以获取更高的经济利益。