GSDMD调控非酒精性脂肪肝中细胞焦亡的研究进展

范祺，郭翼宁，张卫光

（北京大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系，北京 100191）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是最常见的慢性肝病之一，在美国，NAFLD的患病率高达25%[1]。亚太地区的患病率为20%[2]，近几年随着人们饮食结构及生活方式的改变，NAFLD的发病逐渐有着年轻化的趋势，已成为全世界公共卫生领域的重大负担。如果缺乏有效的干预措施，会导致肝细胞逐渐被破坏，使得NAFLD转化为非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH），最终进展至肝纤维化、肝硬化和肝癌[3]。而目前人们对于NAFLD病理机制认识尚浅，治疗措施以生活方式干预和降血脂治疗为主，缺乏有效的对策。如何能延缓NAFLD进展甚至逆转这一过程一直是人们关注的热门话题。

细胞焦亡是近年来新发现的一种细胞程序性死亡方式，和细胞凋亡不同，焦亡的发生常常伴随着细胞的胀破，内容物的外泄，进而引发严重的炎症反应。它的执行分子是一种称为gasdermin D (GSDMD)的打孔蛋白。GSDMD被活化后会形成聚合物并与细胞膜上的脂质分子形成孔道。随着研究的不断深入，人们逐渐发现在NAFLD发展成为NASH的过程中，细胞焦亡起着十分重要的作用[4]，不仅发生在肝细胞中，在肝库普弗细胞中也有存在。研究表明这一过程可能与脂质的沉积有关，且会加重肝脏的炎症反应和纤维化的进程。针对焦亡设计NAFLD的新型治疗药物会是一个前景广阔的研究领域。本文将具体介绍细胞焦亡这一细胞程序性死亡方式的分子机制，并关注其执行分子GSDMD在NAFLD中的作用。

1 Gasdermin家族成员与GSDMD

Gasdermin蛋白最早被发现位于胃肠道（gastrointestinal tract）上皮和皮肤真皮层（dermis），因此被命名为Gas-dermin[5,6]。在人体内已经发现6种gasdermin家族的成员，gasdermin A～E（GSDM A～E）和pejvakin（PJVK）[5,7]。Gasdermin蛋白具有介导细胞死亡和炎症反应的作用，它可以与细胞膜上的脂质结合并在细胞膜上打孔，导致细胞内容物外泄。其中GSDMD的活化涉及到炎性小体的激活，与细胞焦亡密切相关。

除PJVK外，其余的gasdermin蛋白均包含2个结构域：C端结构域（GSDM-CT）和N端结构域（GSDM-NT）[8]。具有打孔功能的并非完整的gasdermin蛋白，而是被切割后独立出来的GSDMNT。正常情况下，GSDM-CT可以抑制GSDM-NT的打孔作用，唯有当GSDM-NT从GSDM-CT解脱开来后才能发挥功能，这一现象也称作gasdermin蛋白的自我抑制（auto-inhibitory）[8,9]。目前被证实能够切割GSDMD的仅有caspase-1/4/5/11。Caspase-1的激活需要炎性小体的活化，属于经典的焦亡途径；caspase4/5/11的活化需要LPS的激活，属于非经典的焦亡途径。尽管其他gasdermin家族成员的N端结构域也有打孔功能，但尚无研究表明它们与细胞焦亡相关[7]。

在GSDMD介导细胞膜溶破和细胞焦亡发生的同时，会伴随IL-18和IL-1β的外泄，且这一过程常常在细胞焦亡发生之前就已完成。GSDMD介导的细胞焦亡并非是一个瞬间过程，在焦亡最终发生之前，GSDMD所造成的孔道的数量需要达到一定阈值，而外泄的炎性因子也已经有所积累。这导致细胞焦亡这一程序性死亡方式伴随的炎性反应尤其严重[10,11]。事实上，GSDMD在膜上打孔的直径为12～14nm，而炎性介质IL-1β和IL-18的分子直径只有约4nm，足以从孔道中自由通过[12-14]。然而研究发现分子直径为10nm的乳酸脱氢酶四聚体却不能通过GSDMD打孔的孔道[15]，其对透过分子的选择机制目前还不得而知。

2 细胞焦亡的分子机制

细胞焦亡是一种可溶性的细胞程序性死亡形式，这一概念最早于1992年由Zychlinsky等[16]提出。其主要特点是细胞质的迅速崩解和胞内促炎物质的释放。焦亡的发生依赖于一种半胱天冬酶——caspase-1。Caspase-1是介导焦亡发生的启动因子，研究表明caspase-1敲除的小鼠的细胞凋亡不会受到影响，且可以正常存活[17,18]。而介导细胞凋亡的caspase-3，6和8则不会引起细胞焦亡的发生[19-21]。

可以引起细胞焦亡的因素包括细菌、病毒感染所释放的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）和过度沉积的脂质等损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）。这些分子模式和细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）结合后，会招募细胞内的炎性小体（主要是NLRP3）。NLRP3会激活下游的ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD），ASC作为信号放大的中间接头蛋白，会大量激活caspase-1[22]。活化的caspase-1一方面会切割proIL-1β和proIL-18形成有活性的炎性介质，另一方面会切割细胞焦亡的关键效应分子—GSDMD（gasdermin D）。被切割后，GSDMD的N末端（GSDMD-NT）会作为焦亡的执行分子，形成聚合体后在细胞膜上打孔，导致细胞的溶解破裂，细胞内容物的外泄，包括IL-1β、IL-18在内的大量促炎因子释放到组织间隙中，导致炎症反应的发生[23,24]。最新的研究结果表明，在LPS诱导的焦亡中，除caspase-1外，caspase-4/5/11的活化也参与了这一进程[25,26]。

GSDMD是细胞焦亡发生过程中至关重要的一环。人体内的GSDMD广泛表达在各个器官和各类细胞中，其中以胃肠道上皮细胞的表达量最为显著[8]。活化的caspase蛋白会切割GSDMD，释放出有功能的GSDMD-NT结构域。GSDMD-NT聚集后与细胞膜上的磷酸肌醇和心磷脂结合，从而对细胞膜溶破打孔。GSDMD孔一般为直径12～14nm的正十六边形结构，孔道形成后，细胞内外的渗透率遭到改变，导致细胞的肿胀溶破[8,27]。有研究表明，GSDMD缺乏的细胞将不会发生细胞焦亡，此时活化的caspase-1将激活caspase-3等凋亡相关蛋白酶，引起细胞凋亡[28]。如果对GSDMD基因进行编辑，使其序列中包含caspase-3识别的切割位点，原本发生凋亡的细胞则会切割GSDMD产生有活性的GSDMD-NT，进而产生细胞焦亡[29]。这些现象说明GSDMD可能是细胞焦亡发生的充要条件，有人也因此将细胞焦亡定义成“由GSDMD执行的细胞溶破性死亡”。

3 细胞焦亡与NAFLD

越来越多的研究表明，NALFD模型中细胞焦亡是NAFLD发病过程的必经之路。大量细胞发生焦亡后，细胞膜溶解破裂，细胞内的大量炎性介质得到释放，加速了肝脏炎症反应和纤维化的进程。

一项研究显示，在用蛋氨酸/胆碱缺乏（methionine/choline de ficient，MCD）饮食饲养小鼠4周后，得到的脂肪肝小鼠中炎性小体NLRP3和炎性介质IL-1β的转录水平显著上调，同时伴随着小叶区炎症加重和肝实质的损伤。免疫组织化学显示，在肝细胞和库普弗细胞中均可检测到阳性NLRP3[30,31]，说明细胞焦亡不仅发生在肝细胞中。在同样是MCD饮食诱导的NAFLD/NASH模型小鼠中，Xu[32]等人的研究结果显示，GSDMD及其切割后的活性产物GSDMD-NT的表达量远高于正常对照组[32]。此外，作者还发现在同样的MCD饮食诱导脂肪肝模型中，Gsdmd-/-小鼠相比于野生型小鼠起到了显著的保护作用。另有研究表明，Caspase-1-/-小鼠在接受高脂饮食诱导后肝细胞死亡的情况未有明显好转[33]；相反，在Nlrp3-/-小鼠的MCD饮食诱导实验中，发现经过基因编辑的小鼠肝细胞死亡的数量及肝损伤的程度远小于正常小鼠[34]。这意味着NAFLD发病过程中的细胞焦亡可能并非是caspase-1依赖的，但涉及到炎性小体NLRP3的激活，最终也要依靠GSDMD作为效应分子来执行细胞焦亡。

在细胞焦亡这一死亡形式被定义之后，另有研究认为它或是脂质沉积的下游结果。Cannito[35]等人的实验表明，具有脂毒性的载脂细胞释放的微泡（MVs）可以在肝细胞和巨噬细胞当中激活炎性小体NLRP3。炎性小体激活需要NF-κB介导的NLRP3、前体caspase-1（pro-caspase-1）和前白细胞介素-1（pro-Interleukin-1,pro-IL-1）表达的上调，随后炎性小体复合物形成，细胞发生焦亡，最终导致IL-1β和IL-18的释放增加[36]。

4 GSDMD的调控与非酒精性脂肪性肝病中的治疗

Xu[32]等人的研究发现，在NAFLD疾病模型的小鼠中，GSDMD的水平与其NAFLD活动度评分（NAFLD activity score, NAS）以及肝纤维化的程度均成正相关[32]。这项研究表明焦亡的发生以及GSDMD的过表达在脂肪性肝炎的发生过程当中具有非常重要的作用，对NAFLD的治疗以及病情评估均提供了一个潜在的方向。

GSDMD作为焦亡的最终执行者，通过控制细胞因子分泌、激活NF-κB通路、调节脂质生成，在脂肪性肝病向脂肪性肝炎进展的过程中扮演重要角色[34]。一方面，GSDMD导致细胞焦亡溶破后，胞内的炎性因子IL-1β等直接释放到组织间隙中，这是直接的促炎过程。Gsdmd-/-的脂肪肝模型小鼠表现出细胞因子分泌量的明显减少[4]。另一方面，GSDMD诱导IL-1β、TNF-α和MCP-1的表达后，还会导致NF-κB信号通路的激活，引起巨噬细胞的募集，这是间接的促炎过程。除此之外，GSDMD的表达还会促进脂质的生成，抑制脂质的溶解，通过加重脂质的沉积来加速NAFLD的进展。研究发现Gsdmd-/-的小鼠会有脂肪生成基因Srbp1c的下调和脂肪抑制基因 Pparα、Aco、Lcad、Cyp4a10和 Cypa14的上调，从而对肝脂肪变性具有保护作用[37]。

研究者们日渐意识到细胞焦亡在NAFLD中的重要作用，将细胞焦亡作为治疗靶点的研究越来越多。其中，抗caspase药物，抗炎性小体药物等的相关研究已取得了初步的进展。最近的研究则关注到一些泛caspase抑制物的应用，它们不仅能抑制caspase-3、8，还能抑制焦亡相关的caspase-1、4、11等。包括IDN-6556、VX-166在内的多种泛caspase抑制剂均被证实在小鼠NASH模型中具有缓解肝脏损伤，减轻炎症和纤维化的作用[38-40]。作为细胞焦亡过程中的启动分子，炎性小体NLRP3也可以作为治疗的靶点。进来，辉瑞公司发现的一种小分子细胞因子释放抑制物MCC950（曾用名CRID3）被证实具有选择性抑制NLRP3活化的功能[41]。MCC950已在小鼠脑膜脑炎、NAFLD等疾病模型中得到应用，均可以抑制其中的细胞焦亡过程，从而缓解疾病的进程[42,43]。

GSDMD是细胞焦亡最终的执行者，也是最关键的一环。如前所述，Gsdmd-/-的基因编辑小鼠在MCD诱导的NAFLD小鼠模型中具有显著的保护作用。Gsdmd-/-的NAFLD模型小鼠相比于野生型小鼠，炎性因子IL-1β、TNF-α等的分泌量显著减少，且脂溶基因Pparα等的表达量亦有上调。因此，我们有理由推测GSDMD抑制药物可以在NAFLD的治疗中占据一席之地。然而截至目前尚无将GSDMD作为靶点的相关报道，这将是一个拥有广阔前景的研究方向。

5 展望

细胞焦亡是一种新型的细胞死亡方式，是一种caspase依赖性的细胞胀亡，与炎症反应的发生有着密切的关系。它与细胞凋亡、程序性坏死等其他死亡形式共同调控细胞命运，决定疾病进程。目前已证实细胞焦亡在NAFLD发病及其向NASH进展的过程中起了重要的作用，而GSDMD的表达与细胞焦亡的发生息息相关，通过调控GSDMD的表达，抑制NAFLD模型中的细胞焦亡过程可以保肝抗炎，延缓病情的进展。这将为NAFLD的治疗开辟一个全新的思路。进一步探究细胞焦亡在NAFLD中的作用，并设计针对细胞焦亡的靶向药物，有助于人们对NAFLD发病机制的理解，改善NAFLD患者的预后。