响应面法优化树莓鞣花酸提取工艺及其体外抗氧化活性

崔珊珊，毕凯媛，吴 杰，尚宏丽

(锦州医科大学食品科学与工程学院，辽宁省肉类加工与质量安全控制工程技术研究中心，辽宁锦州121001)

树莓，又名山抛子、覆盆子和托盘等，为蔷薇科悬钩子属灌木型植物，以东北分布较多。树莓含有丰富的鞣花酸、黄酮和水杨酸等多种生物活性成分，具有极高的开发和利用价值。鞣花酸是一种多酚二内酯，它是没食子酸的二聚衍生物，广泛分布于各种植物组织和果实中，呈游离形式或缩合形式。研究者从草莓、石榴、葡萄、树莓和板栗发现不同含量的鞣花酸，其中树莓中鞣花酸的含量在水果中堪称“之最”［1－5］。树莓是最早一批被研究人员发现其含有天然鞣花酸的植物之一［6］。鞣花酸具有抗菌［7］、抗氧化［8－9］、抗炎［10］、镇痛［11］等多种特性，在肿瘤方面也具有很高的应用价值［12－13］，堪称“癌症的天敌”。在国外，鞣花酸已被许多研究机构开发，广泛应用于食品、医药、化妆品等各个领域。而且在国际市场上鞣花酸的保健品比一般的保健品价位要高出很多，但国内对它的开发还处于研发阶段［10］。

鞣花酸等多酚类化合物的提取方法，多集中于溶剂浸提法和超声波辅助提取，研究者利用超声波辅助溶剂浸提法［14］、乙酸乙酯萃取法［15］、酸水解法［16］、分离沉淀法［17］提取植物中鞣花酸等多酚类化合物。这些传统的方法提取多酚由于提取时间长，很容易使多酚化合物降解，影响其抗氧化活性。微波辅助提取技术，具有提取时间短暂，提取得率高等优点［18］，适合多酚及黄酮类化合物的提取。目前，关于微波辅助溶剂提取树莓鞣花酸实验还鲜见报道。

本实验以树莓为原料，利用微波辅助溶剂提取树莓鞣花酸，利用高效液相色谱(HPLC)测定提取量，通过响应面试验设计优化微波辅助提取树莓鞣花酸工艺，与传统盐酸水解法对比其体外抗氧化活性研究，为进一步深入研究树莓鞣花酸生物活性功能以及相关功能性食品开发提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红树莓(Rubus idaeus L.cv.Fertod Zamatos) 锦州七里河树莓种植基地，置于－80℃冰箱中冻存备用;鞣花酸标准品(纯度大于或等于98%) 武汉培安生物科技有限公司;甲醇(色谱纯) 上海安谱实验科技股份有限公司;磷酸(HPLC级)、邻苯三酚、无水乙醇、盐酸、硫酸亚铁、EDTA、30%过氧化氢(均为AR) 天津科密欧化学试剂有限公司;实验用水 自制实验室蒸馏水和去离子水;邻菲罗啉、DPPH(均为AR) 天津永大化工试剂有限公司;PBS缓冲液 北京索莱宝科技有限公司;Tris－HCl缓冲液 上海尔武实业有限公司。

Agilent1200液相色谱系统G1315D型DAD检测器 安捷伦有限公司;COWB微波萃取设备 江阴辰欧微波能系统设备有限公司;FD－1A－50真空冷冻干燥机 上海豫明仪器有限公司;800Y高速多功能粉碎机(70～300目) 永康市铂欧五金制品有限公司;DM0412E低速离心机 江苏苏博生物医学股份有限公司;JM－BL电子分析天平 慈溪红钻衡器设备有限公司;数字恒温水浴锅(HH－6，常州市万丰仪器制造有限公司);RE－5250旋转蒸发器 巩义市英峪高科仪器厂;722紫外可见分光光度计 佛山市涵宇骏仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 红树莓鲜果在低温冷冻冰箱中经过预冷处理后，放入真空冷冻干燥机干燥48 h，之后用粉碎机粉碎，粉碎后过80目筛，在－20℃下保存备用。

1.2.2 微波辅助溶剂提取法提取树莓中鞣花酸工艺单因素试验 精确称量0.5 g树莓冻干粉置于25 mL锥形瓶中，按照一定的液料比(mL/g)加入一定浓度的乙醇溶液在一定提取温度下，利用一定的微波功率提取一定的时间后快速冷却，4500 r/min条件下25℃条件下离心20 min，残渣重复提取2次，与上清液合并。树莓鞣花酸粗提物用二甲亚砜(DMSO)定容在25 mL。样品用0.45μm微孔滤膜过滤。用于HPLC检测分析滤液中鞣花酸。所有提取及检测均平行三次［19］。

1.2.2.1 乙醇浓度对鞣花酸含量的影响 试验测定方法同1.2.2，只改变单因素项，其余固定不变。提取时间选择2 min，提取温度60℃，液料比20∶1，微波功率 400 W，乙醇浓度选用 10%、30%、50%、70%、90%。

1.2.2.2 提取时间对鞣花酸含量的影响 乙醇浓度选择50%，控制其他反应条件同1.2.2.1，提取时间选用 1、2、3、4 min。

1.2.2.3 提取温度对鞣花酸含量的影响 乙醇浓度选择50%，控制其他反应条件同1.2.2.1，提取温度选用 40、50、60、70、80 ℃。

1.2.2.4 液料比对鞣花酸含量的影响 乙醇浓度选择50%，控制其他反应条件同1.2.2.1，液料比选用10∶1、20∶1、30∶1、40∶1。

1.2.2.5 微波功率对鞣花酸含量的影响 乙醇浓度选择50%，控制其他反应条件同1.2.2.1，微波功率选用 200、300、400、500、600 W。

1.2.3 响应面试验 在单因素试验结果的基础之上，采用Box－Behnken设计响应曲面试验方案，以树莓鞣花酸提取量作为响应值，对乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比和微波功率五因素进行响应面法优化。各因素及水平编码见表1。

表1 因素及水平编码Tabel 1 Factors and levels code

1.2.4 鞣花酸的HPLC测定 液相色谱条件:色谱柱为Zorbax Eclipse plus C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)。流动相:冰乙酸(A)－甲醇(B)，梯度洗脱程序:0～4 min B由 20%升到 45%，维持 6 min，10～15 min B由 45%升到 70%，15～20 min B升至100%，维持1 min;柱温30℃，运行60 min，进样体积10μL，在280 nm下检测。

鞣花酸标准曲线的绘制:精确配制成6 mg/mL鞣花酸标准溶液，精确吸取 0.5、1.0、2.5、3.5、5.0、6.5 mL置于10 mL容量瓶中，分别配制成30、60、150、210、300 和390 mg/100 g标准溶液，用DMSO 定容至刻度并摇匀，取标准溶液各10μL进样，测定峰面积，以标准样品浓度(mg/100 g)为横坐标，以标准样品的峰面积为纵坐标，绘制出鞣花酸标准曲线。

1.2.5 两种提取方法所得鞣花酸含量的比较 采用传统盐酸水解提取方法［20］，方法略微修改，精确称取0.5 g树莓冻干粉置于50 mL带盖锥形瓶中，加入10 mL 1 mol/L盐酸混匀，60℃水浴1 h后过滤收集滤液;滤渣重复上述步骤提取1次，合并滤液得鞣花酸粗品提取液;滤液在85℃下真空旋转干燥烘干水分，测定鞣花酸含量，与本研究利用响应面优化出最佳提取出的鞣花酸含量进行比较。

1.2.6 两种提取方法得到的鞣花酸中羟自由基清除能力的测定 将树莓鞣花酸提取物用蒸馏水配成浓度分别为 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的样品溶液。损伤管:取1.0 mL的75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液加入2.0 mL p H7.4的PBS缓冲液和0.5 mL蒸馏水，充分混匀后加入1.0 mL的75 mmol/L硫酸亚铁，混匀后再加入1.5 mL 0.01%(v/v)的双氧水，37℃水浴60 min。未损伤管:以蒸馏水代替双氧水［21］。样品管:以样品溶液代替蒸馏水。在508 nm处测定吸光值A。清除率按下式计算:

式中:Aa:样品吸光度;Ab:损伤管吸光度;Ad:未损伤管吸光度;R:清除率(%)。

1.2.7 两种提取方法得到的鞣花酸中DPPH自由基清除能力的测定 取1.2.6所配制的不同质量浓度的样品溶液1 mL，加入3 mL DPPH无水乙醇溶液(0.04 g/L)，混匀后在室温下反应30 min，在517 nm下测定吸光度 Ai。空白组以无水乙醇溶液代替DPPH溶液，对照组以蒸馏水代替样品溶液［22］。清除率按下式计算:

式中:A0:对照组吸光度;Ai:样品组吸光度;Aj:空白组吸光度;I:清除率(%)。

1.3 数据处理

数据处理采用SPSS 21.0软件进行方差分析(ANOVA)，p＜0.05差异性显著。并采用 Design－Expert 7.0.0进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 鞣花酸标准曲线

依据将不同浓度标准品溶液，分别进样后，所得色谱峰的位置如图1所示。标准样品浓度(mg/100 g)是横坐标，标准样品的峰面积是纵坐标。绘制标准曲线，计算线性回归方程。y=32772x－26328，R2=0.9999，线性范围为 30～400 mg/100 g，保留时间为34.266 min。

图1 鞣花酸标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of ellagic acid standard

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对树莓鞣花酸提取量的影响 由图2可知，在乙醇浓度10%～50%时，树莓鞣花酸提取量随着乙醇浓度的增大逐渐增大，在乙醇浓度达到50%时，树莓鞣花酸提取量达到峰值78.93 mg/100 g，随着乙醇浓度增多，多酚提取量显著下降(p＜0.05)，可能是因为少量鞣花酸析出，过滤、离心时沉淀下来，造成鞣花酸含量减少一小部分［23］，所以选择50%的乙醇浓度为宜。

图2 乙醇浓度对树莓鞣花酸提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the content of ellagic acid in raspberry

2.2.2 提取时间对树莓鞣花酸提取量的影响 由图3可以看出，提取时间在1～2 min时，提取时间为2 min时所得到的树莓鞣花酸提取量高于提取时间为1 min时所得到的树莓鞣花酸提取量;当提取时间达到2 min时，树莓鞣花酸提取量达到峰值为82.33 mg/100 g，随着提取时间的延长，多酚提取量显著下降(p＜0.05)，可能因为乙醇具有挥发性，随着提取时间的延长乙醇的有效浓度降低，致使鞣花酸提取量降低，所以选择2 min进行后续研究。

图3 提取时间对树莓鞣花酸提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on the content of ellagic acid in raspberry

2.2.3 提取温度对鞣花酸提取量的影响 从图4可以看出，在40～60℃时，树莓鞣花酸提取量随着提取温度的升高而增加。当提取温度升高到60℃时，树莓鞣花酸提取量达到峰值80.60 mg/100 g，随着提取温度的继续升高，树莓鞣花酸提取量显著下降(p＜0.05)，可能是由于温度的过度增加对鞣花酸的结构造成一定破坏［24］，所以选择提取温度为60℃。

图4 提取温度对树莓鞣花酸提取量的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the content of ellagic acid in raspberry

2.2.4 液料比对鞣花酸提取量的影响 从图5可以看出，液料比为20∶1时所测得到的树莓鞣花酸提取量高于液料比为10∶1时所测，这是因为液料比的扩大可以增大溶剂与物料的接触面积，能使更多的鞣花酸溶解出来;当液料比达到20∶1时，树莓鞣花酸提取量达到峰值81.70 mg/100 g，随着液料比的继续升高，树莓鞣花酸提取量显著下降(p＜0.05)，说明鞣花酸溶解达到平衡，增加溶剂体积不能使鞣花酸继续溶解甚至减少，所以选择液料比20∶1进行后续研究。

图5 液料比对树莓鞣花酸提取量的影响Fig.5 Effect of liquid to material ratio on the content of ellagic acid in raspberry

2.2.5 微波功率对鞣花酸提取量的影响 从图6可以看出，当微波功率在200～400 W时，树莓鞣花酸提取量随着微波功率的增大而增多，此时微波破坏树莓细胞壁的效果与微波功率成正比。当微波功率达到400 W时，树莓鞣花酸提取量达到峰值82.50 mg/100 g随着微波功率的继续增大，树莓鞣花酸提取量显著下降(p＜0.05)，可能是因为微波功率过大会降解和破坏鞣花酸［25］，所以选择微波功率为400 W适宜。

图6 微波功率对树莓鞣花酸提取量的影响Fig.6 Effect of microwave power on the content of ellagic acid in raspberry

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 树莓鞣花酸提取工艺响应面试验设计方案与结果 利用Design－Expert软件对表2数据进行多元回归拟合。得到鞣花酸提取量二次多项回归模型为:

Y=84.00－1.64A+0.27B+0.16C－1.14D+1.79E+2.09AB+0.3AC－2.00AD－0.010AE+0.25BC+0.73BD－0.84BE－1.15CD－1.00CE+1.49DE－4.79A2－5.16B2－11.80C2－5.55D2－8.49E2

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experiment design and results

续表

从表3的方差分析，模型方程p＜0.0001，说明以响应值(鞣花酸提取量)建立的回归模型极显著。相关系数R2=0.9505，修正系数R2adj=0.9092，表明模型的实测值与预测值吻合良好，失拟项p＞0.05，失拟不显著，表明不可忽略的因素对试验结果没太大影响。提取时间和微波功率对鞣花酸含量的线性影响极显著(p＜0.01)，液料比对鞣花酸提取量的线性影响显著(p＜0.05)。二次项中提取时间、提取温度、乙醇浓度、液料比和微波功率对鞣花酸提取量的曲面效应极显著(p＜0.01)。在相互作用中，提取时间和提取温度显著(p＜0.05)，提取时间和液料比显著(p＜0.05)。该方程与试验结果吻合较好，可用于鞣花酸提取试验的分析和预测。由F检验可知，影响Y的主要因素依次为微波功率＞提取时间＞液料比＞提取温度＞乙醇浓度。

表3 拟合二次多项式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the quadratic polynomial model

2.3.2 因素的交互作用分析 利用Design－Expert 7.0.0软件对二次回归模型进行规范的分析，所得到的响应面及等高线图可以很好地反映两个因素的协同作用对鞣花酸提取量的影响。

从图7、图8可以清楚的了解到各因素交互作用的响应面分析结果，从中可以直观的看出提取时间和提取温度的相互作用对鞣花酸提取影响显著，表现在其等高线图为椭圆形;同时提取时间和液料比的相互作用对鞣花酸的提取影响也显著。

图7 提取时间和提取温度相互作用对树莓鞣花酸提取量的响应面与等高线图Fig.7 Response surface and contour map manifesting the interactive results of extraction time and temperature on the extraction amount of raspberry ellagic acid

图8 提取时间和液料比相互作用对树莓鞣花酸提取量的响应面与等高线图Fig.8 Response surface and contour map manifesting the interactive results of extraction time and liquid to material ratio on the extraction amount of raspberry ellagic acid

2.3.3 验证试验 根据响应面分析软件得出最佳工艺条件为:提取时间1.84 min，提取温度59.81℃，乙醇浓度50%、液料比19.38∶1、微波功率410.08 W，此条件下，鞣花酸提取量为84.26 mg/100 g。为了便于实验操作，提取条件设为:提取时间1.8 min，提取温度60℃，乙醇浓度50%，液料比19∶1，微波功率411 W，在此条件下进行3组平行实验，鞣花酸提取量为(82.75±1.05)mg/100 g，由于鞣花酸的天然活性，因此具有重要的保健价值。相差百分率为1.80%，实际结果与理论预测吻合度很高，因此本实验得到的最优条件准确可靠有参考应用价值。目前关于鞣花酸的测定方法有紫外分光光度法［26］、高效毛细管电泳法［27］、返滴定法等，本实验采用的高效液相色谱法(HPLC)具有许多特点，如简单、快速、准确［28－30］。李晓平［31］、张成涛等［32］用高效液相色谱法得到的树莓鞣花酸的提取量分别为223 mg/kg和43.5 mg/g，与本实验结果存在差异，可能是因为种植环境、品种、种植气候等的不同造成的。

2.4 不同提取方法鞣花酸提取量与抗氧化活性比较

微波辅助溶剂提取树莓鞣花酸量显著高于传统盐酸水解提取所得提取量(p＜0.05)，微波辅助溶剂提取树莓鞣花酸量为(82.75±1.05)mg/100 g，提高了20.42%(图9)。自由基与人体许多疾病的发生有关，当体内自由基过多时，自由基清除剂就显得非常重要，因而进一步比较其总还原能力、DPPH自由基和羟自由基的清除能力结果见图10所示。微波辅助溶剂所提取到的树莓鞣花酸对羟自由基、DPPH自由基的清除能力显著高于传统盐酸水解(p＜0.05)。这可能与两种不同提取方法所得到酚类成分有关，多酚单体之间抗氧化相互作用与混合物中多酚的结构类型、数量和比例有关［33］，因此表现出的抗氧化性能不同。同时微波提取的时间相对传统方法提取时间短暂，与传统盐酸水解提取法［20］和超声辅助提取法［14］相比，鞣花酸提取量高、提取溶剂用量少，更好地保护了树莓鞣花酸的抗氧化活性，为进一步深入树莓鞣花酸生物活性功能以及相关功能性食品开发提供了一定研究基础。

图9 不同提取方法提取的树莓鞣花酸提取量比较Fig.9 Comparison of extraction amount of ellagic acid extracted by different extraction methods

图10 不同提取方法提取的红树莓鞣花酸清除羟自由基和DPPH自由基能力比较Fig.10 Comparison of scavenging activities of hydroxyl radicals and DPPH radicals extracted from ellagic acid extracted by different extraction methods

3 结论

本研究利用微波辅助提取树莓鞣花酸，通过响应面试验设计对鞣花酸的提取条件进行优化，影响树莓鞣花酸的主要因素依次为微波功率＞提取时间＞液料比＞提取温度＞乙醇浓度。得出最佳提取工艺条件为:提取时间1.8 min，提取温度60℃，乙醇浓度50%，液料比19∶1，微波功率411 W，得到鞣花酸提取量为(82.75±1.05)mg/100 g，高于传统盐酸水解法在最佳提取条件下所测树莓鞣花酸提取量，相差百分率为1.80%，实际结果与理论预测高度吻合，因此本实验得到的最优条件准确可靠有参考应用价值。通过微波辅助溶剂提取法较传统盐酸水解提取法树莓鞣花酸抗氧化活性对比发现，微波辅助溶剂法所得鞣花酸对羟自由基清除能力、清除DPPH自由基能力都显著高于传统盐酸水解法所得鞣花酸对羟自由基清除能力、清除DPPH自由基能力，说明微波辅助溶剂提取法，不但提取时间短暂，提取溶剂用量少，而且更好地保护了树莓鞣花酸的抗氧化活性，可为树莓鞣花酸工业生产提供一定参考。