spoIIE基因缺失对克劳氏芽孢杆菌淀粉酶酶活的影响

张 虎，肖 静，原梨萍，汪俊卿，王瑞明

(齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院，生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，山东济南250353)

克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)是一株产芽孢革兰氏阳性菌株，其能够产生多种酶，主要有碱性蛋白酶、淀粉酶等［1］。尤其在产淀粉酶时，该菌在进入稳定期后，开始形成芽孢，芽孢形成后在发酵产酶过程中将严重影响目标酶活及产量［2－4］。因此通过了解芽孢杆菌芽孢形成机制［5－8］，以及芽孢的形成对B.clausii QL－1淀粉酶产量的影响，而使该菌株丧失或降低芽孢生成能力，这将在一定程度上有利于淀粉酶酶活及产量的提高。

目前国内外多以枯草芽孢杆菌为模式菌株，对芽孢形成机制及关键基因进行了大量研究［9－10］，而至今并未见有对克劳氏芽孢杆菌，芽孢形成以及芽孢的形成机制对于该菌发酵产酶方面研究的报道。对于枯草芽孢杆菌相关研究表明芽孢形成主要分为8个阶段，每个阶段需要多个基因共同调控［11－12］，并且目前国内外，对芽孢形成相关基因的研究多集中在spo0A 及 sigma 因子［13－14］，而对其它芽孢形成相关基因研究甚少，而在枯草芽孢杆菌中研究表明spoIIE基因为芽孢形成第二阶段关键调控基因，它的编码产物为蛋白磷酸酶，它能够保持前芽孢中重要的σF因子的活性，从而保证芽孢的形成顺利的向下一个阶段过渡，同时它在前芽孢和母细胞不对称分裂及基因的不对称分布过程中发挥重要作用［15－16］。并且目前对芽孢基因研究的菌种范围较狭窄，多局限于对芽孢的形成及菌体生长方面的影响，而对于菌体发酵产物的影响研究较少。

目前国内外对芽孢杆菌淀粉酶产量方面的研究，多集中在培养基、工艺参数以及淀粉酶基因克隆的外源表达［17－18］，并未见从芽孢形成相关基因方面入手，研究其对菌株淀粉酶产量影响的报道。但是相关文献已有报道，枯草芽孢杆菌spo0A基因缺失菌株会影响胞外蛋白酶的产量［19］，因此，针对以上对芽孢形成相关的基因研究的局限性，本文从目前相关研究甚少的芽孢形成关键基因spoIIE入手，通过构建B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株，研究该基因对 B.clausii QL－1芽孢形成、发酵产α－淀粉酶以及通过初步补料发酵芽孢缺失型菌株的高密度连续发酵对生物量的影响。这对于高产α－淀粉酶芽孢杆菌类工业生产菌株的构建具有一定的借鉴意义，对于芽孢形成相关基因spoIIE的功能得到进一步了解。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

克劳氏芽孢杆菌(B.clausii QL－1) 野生菌株;pHT01质粒 用于Cmr片段的扩增，均由山东省微生物工程重点实验室保藏;引物 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;LB培养基 用于克劳氏芽孢杆菌的培养;发酵培养基(可溶性淀粉20 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉20 g/L、Na2HPO420.66 g/L、NaH2PO46.6 g/L);补料培养基同发酵培养基;可溶性淀粉培养基固体:牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L、可溶性淀粉2 g/L、琼脂20 g/L;GM(菌体增殖培养基) 酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、山梨醇91 g/L;ETM(电转缓冲液)山梨醇91 g/L、甘露醇91 g/L、甘油100 g/L;RM(菌体复苏培养基)酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、山梨醇69 g/L、甘露醇91 g/L;限制性内切酶 宝生物工程(大连)有限公司;高纯度质粒小量快速抽提试剂盒 艾德莱生物技术有限公司;Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。

ZQZY－CS恒温振荡培养箱 上海知楚有限公司;GNP－9080型隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;Centrifuge 5804R低温冷冻离心机、4380型电转仪德国 Eppendorf公司;Veriti96孔热循环梯度PCR仪 美国应用生物系统公司;MD2000H核酸超微量分光光度计 美国BioFure公司;UVI Essential V6凝胶成像仪 英国Uvitec公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 spoIIE基因扩增引物spoIIE F1/spoIIE R1，Cmr基因扩增引物 CmrF2/CmrR2，引物序列见表1。

表1 本研究所用引物及序列Table 1 Primers and sequences used in the study

1.2.2 同源重组片段spoIIE－Cmr的制备 使用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取B.clausii QL－1菌体基因组，使用高纯度质粒小量提取试剂盒提取p HT01质粒，以 B.clausii QL－1菌体基因组为模板spoIIE F1与spoIIE R1为引物PCR扩增获得spoIIE片段;以pHT01质粒为模板，CmrF2和CmrR2为引物PCR扩增获得Cmr片段，以上扩增条件为:95℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min 20 s(spoIIE 片段)，2 min 30 s(Cmr片段)30个循环;72℃延伸10 min，4℃保存;使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，对以上两个片段胶回收后，以spoIIE及Cmr为模板进行重叠延伸PCR，获得同源重组片段spoIIE－CmrR，扩增分两步条件为:95℃预变性5 min;95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，5个循环;72℃延伸5 min95℃预变性5 min;95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3 min 30 s，30个循环;72℃延伸10 min，4℃保存，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收所得的spoIIE－Cmr片段，－20 ℃保存。

1.2.3 同源重组片段spoIIE－Cmr回收产物的酶切及浓缩 将1.2.2所得的spoIIE－Cmr同源重组片段制备成20μL的酶切体系:1μL限制性内切酶Bam HⅠ，2 μL 10×Fast Digest Buffer，spoIIE－Cmr同源重组片段添加1μg，最后用 dd H2O将酶切体系补充到20μL，37℃酶切1 h;向酶切后的产物中，加入1/10体积3 mol/L醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃条件下放置20 min，12000 r/min离心5 min得DNA沉淀;加入70%乙醇重悬 DNA沉淀，12000 r/min离心5 min除去乙醇，37℃风干，加入25 μL ddH2O重悬，制得500 ng/μL的spoIIE－Cmr浓缩DNA溶液。

1.2.4 克劳氏芽孢杆菌B.clausii QL－1感受态的制备

甘油管挑取一接种环B.clausii QL－1菌液划线于LB平板，37℃培养18 h，反复活化两代，挑取二代平板上的单菌落接种于15 mL的LB培养基，37℃、200 r/min培养12 h;将菌液转接于50 mL菌体增殖培养基中，使初始菌液OD600=0.15，37℃、200 r/min培养至OD600=0.95;将菌液倒入预冷的50 mL离心管中，10 min，4 ℃，5000 r/mim 离心 10 min，收集菌体;用预冷的20 mL电转缓冲液洗涤3次后，重悬、分装，即为制备好的感受态细胞［20］，－80℃保存。

1.2.5 同源重组片段spoIIE－Cmr的电转化、阳性重组菌株的鉴定及遗传稳定性验证 将制备的B.clausii QL－1感受态细胞与spoIIE－Cmr浓缩重组片段于冰上以10∶1比例轻轻吹打混匀，将混合物移入2 mm 电转杯，冰浴3 min，1500 V、5 ms电转，电转结束后，立即加入1 mL的菌体复苏培养基，37℃，180 r/min复苏4 h后涂布于含氯霉素(25μg/mL)的LB固体培养基中培养18 h左右，筛选抗氯霉素菌株，以提取到的阳性菌株基因组 DNA为模板，spoIIE F1和CmrR2为引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳验证，最终获得阳性重组菌株B.clausii QL－1 ΔspoIIE;将B.clausii QL－1ΔspoIIE重组菌于LB液体培养基中，37℃、200 r/min传代15次，进行菌落PCR扩增验证扩增条件参见1.2.2中重叠延伸PCR第二步条件。

1.2.6 B.clausii QL－1ΔspoIIE重组菌芽孢形成检测 B.clausii QL－1与 B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株分别以2%接种量接种于 LB液体培养基，37℃、200 r/min培养28 h，菌液于80℃水浴处理10 min，将未处理的菌液与处理的菌液分别稀释适当倍数涂布于LB固体平板上，37℃培养18 h，平板计数法记录并计算芽孢生成率，产芽孢率(%)=芽孢数/(芽孢数+营养细胞数)×100。

1.2.7 B.clausii QL－1与 B.clausii QL－1ΔspoIIE 生长周期及菌体干重的测定 挑取B.clausii QL－1与B.clausii QL－1ΔspoIIE单菌落于15 mL LB液体培养基，37℃、200 r/min培养12 h，将菌液转接至100 mL LB液体培养基至初始 OD600=0.1左右，37℃、200 r/min培养，每隔4 h取样，在600 nm波长下测定菌体浓度。每隔12 h取样10 mL，离心得菌体沉淀，于70℃恒温干燥箱干燥至恒重后测其干重。

1.2.8 B.clausii QL－1 与 B.clausii QL－1ΔspoIIEα－淀粉酶酶活测定 分别将出发菌株B.clausii QL－1和重组菌株B.clausii QL－1ΔspoIIE单菌落点涂于淀粉平板中央，于37℃培养，滴加碘液观察并测量透明圈大小。分别以2%接种量接种于发酵培养基，37℃、200 r/min培养，每隔6 h取样，4℃、12000 r/min离心8 min取上清，按照国标GB/T 24401－2009所示方法测定淀粉酶酶活，按菌体干重换算为U·g－1。

酶活定义:于60℃，pH6.0条件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即为一个酶活力单位(U·mL－1)。

1.2.9 B.clausii QL－1ΔspoIIE补料与未补料发酵对比

将B.clausii QL－1ΔspoIIE菌液以2%接种量转接至两瓶1 L发酵培养基，加入初始浓度为25 mg/mL的氯霉素1 mL，37℃，200 r/min培养至30 h，对其中之一的培养基开始补加15 mL补料培养基，每隔6 h补加一次，培养过程中不同时间段对补料与未补料的发酵液进行取样测OD600、菌体干重及α－淀粉酶酶活。

1.3 数据处理

本文中引物设计采用Oligo 7设计，实验采用三次重复，数据由Execl处理，Origin 8绘制图形。

2 结果与分析

2.1 spoIIE－Cmr重组片段的构建

以B.clausii QL－1出发菌株基因组为模板，spoIIE F1和spoIIE R1为引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1(a)，成功获得791 bp的spoIIE片段;以质粒 p HT01为模板，CmrF2和CmrR2为引物PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1(b)，成功获得1259 bp的Cmr片段;以胶回收所得的spoIIE片段和Cmr片段为模板，spoIIE F1和CmrR2为引物重叠延伸PCR，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1(c)，于2000 bp左右出现特异性条带，与理论长度2028 bp相符，成功获得同源重组片段 spoIIE－Cmr。

图1 spoIIE、Cmr spoIIE－cmr片段PCR扩增验证电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified and colonyPCR vertification products of spoIIE，Cmr，spoIIE－cmr注:a:M为 DL5000 Marker;1～4泳道为 spoIIE片段，长791bp;b:M为DL5000 Marker;1～4泳道为Cmr片段，长1259 bp;c:M为DL5000 Marker;1～4泳道为重叠片段spoIIE－Cmr，长 2028 bp。

2.2 重组菌株的筛选及遗传稳定性验证

将spoIIE－Cmr片段经Bam HⅠ单酶切后进行浓缩，测其浓度为528 ng/μL，利用电穿孔转化法将spoIIE－Cmr片段导入 B.clausii QL－1，37 ℃过夜培养，Cmr抗性平板长出的单菌落即为成功发生整合的转化子，挑取转化子继续传代培养，菌落PCR验证，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2，同样于2000 bp附近出现特异性目的条带，表明成功获得遗传稳定性较好的重组菌株B.clausii QL－1ΔspoIIE。

图2 B.clausii QL－1ΔspoIIE重组菌株遗传稳定性菌落PCR扩增验证电泳图Fig.2 Genetic stability colony PCR vertification of B.clausii QL－1ΔspoIIE注:M为DL5000 Marker;1～4泳道为传代10次后B.clausii QL－1ΔspoIIE菌落PCR扩增验证spoIIE－Cmr条带，长2028 bp。

2.3 spoIIE基因对芽孢萌发及菌体干重的影响

通过平板计数法对出发菌株及重组菌株芽孢萌发情况进行比较，结果见图3，B.clausii QL－1芽孢萌发数为3.93×108CFU·mL－1，B.clausii QL－1 菌体数为 4.67 ×108CFU·mL－1，计算得到出发菌株 B.clausii QL－1 芽孢生成率为 84.15%，B.clausii QL－1ΔspoIIE芽孢萌发数为 2.53 ×106CFU·mL－1，B.clausii QL－1 ΔspoIIE菌体数为 5.4 ×108CFU·mL－1，通过计算得B.clausii QL－1ΔspoIIE芽孢生成率为0.48%。通过对B.clausii QL－1spoIIE基因敲除，芽孢生成率明显降低且菌体数得到极大提高，说明spoIIE基因在克劳氏芽孢杆菌芽孢形成和菌体生长中起到重要作用。为进一步比较出发菌株及spoIIE基因缺失菌株生物量变化程度，对出发菌株B.clausii QL－1及重组菌株B.clausii QL－1ΔspoIIE进行了生长曲线及干重测定，结果见图4与图5，重组菌株 B.clausii QL－1ΔspoIIE与 B.clausii QL－1相比生长趋势基本相同，在稳定期时菌体量稍高，生长繁殖明显加快，在特定时间段生物量(菌体干重)均高于出发菌株，20 h时B.clausii QL－1ΔspoIIE及B.clausii QL－1菌株最大生物量达到最大，分别为3.00、2.50 mg·mL－1，spoIIE 基因缺失菌株 B.clausii QL－1ΔspoIIE较出发菌株生物量提高了20%。

图3 B.clausii QL－1及B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株芽孢萌发结果Fig.3 Results of spore germination results of B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

图4 B.clausii QL－1及 B.clausii QL－1ΔspoIIE菌体LB培养基生长曲线测定结果Fig.4 Results of determination of growth curve in LB medium of B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

图5 B.clausii QL－1及 B.clausii QL－1ΔspoIIE菌体细胞干重测定结果Fig.5 Results of determination of bacterial cells dry weight in B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

2.4 spoIIE基因对淀粉酶的影响

可溶性淀粉平板初筛，结果见图6，重组菌株B.clausii QL－1ΔspoIIE 较出发菌株B.clausii QL－1淀粉水解透明圈明显增大，B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株淀粉水解透明圈与菌落直径比为2.96，B.clausii QL－1透明圈与菌落直径比为1.42，可以得知重组菌株较出发菌株水解淀粉能力明显增强。进一步对重组菌株及出发菌株于发酵培养基发酵培养并测定淀粉酶酶活，结果见图7，B.clausii QL－1ΔspoIIE 及B.clausii QL－1菌株发酵至84 h淀粉酶酶活分别为 4.8×105、0.86×105U·g－1，B.clausii QL － 1ΔspoIIE 淀粉酶酶活是B.clausii QL－1的5.58倍，淀粉酶酶活明显增强。

图6 出发菌株及重组菌株透明圈大小比对图Fig.6 Comparison of the size of the transparent circle produced by B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

图7 B.clausii QL－1 和 B.clausii QL－1ΔspoIIE淀粉酶酶活测定结果Fig.7 Results of determination of amylase activity in B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

2.5 补料与未补料发酵对比

对B.clausii QL－1ΔspoIIE进行初步补料发酵，补料结果如图8所示，菌体的生长在20～30 h内趋于平稳，30 h开始补料，35 h后生物量逐渐升高，对数生长期延长、生物量增大，菌体干重测定如图9所示。由图8和图9可知，进行补料的B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株OD600最大值达到 13.962，生物量(菌体干重)为7.20 mg·mL－1;未补料最大 OD600为9.546，生物量(菌体干重)最大为 5.40 mg·mL－1，B.clausii QL－1ΔspoIIE 菌株生物量补料较未补料提高33.30%，通过补料培养至84 h。如图10所示，B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株α－淀粉酶酶活达到最大为690 U·mL－1，而未补料淀粉酶酶活最大为 492 U·mL－1，B.clausii QL－1ΔspoIIE 菌株补料后生物量及α－淀粉酶酶活均得到较大提高，通过补料使B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株实现了初步高密度连续发酵。

图8 B.clausii QL－1ΔspoIIE补料和未补料生长曲线测定结果Fig.8 Results of determination of B.clausii QL－1ΔspoIIE added nutrition and no added nutrition growth curve

图9 B.clausii QL－1ΔspoIIE补料和未补料菌体干重测定结果Fig.9 Results of determination of B.clausii QL－1ΔspoIIE added nutrition and no added nutrition bacterial cells dry weight

图10 B.clausii QL－1ΔspoIIE补料和未补料淀粉酶酶活测定结果Fig.10 Results of determination of B.clausii QL－1ΔspoIIE added nutrition and no added nutrition amylase activity

3 结论

利用重叠PCR技术，通过电转化将重叠片段spoIIE－Cmr转化到 B.clausii QL－1，成功实现了克劳氏芽孢杆菌spoIIE基因的敲除。通过对构建的B.clausii QL－1ΔspoIIE工程菌株的初步研究，发现 B.clausii QL－1ΔspoIIE较出发菌株芽孢生成率极大降低，生物量提高20%，通过补料分批发酵，B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株生物量又提高了13.30%。表明spoIIE基因不仅是克劳氏芽孢杆菌芽孢形成关键基因，而且对菌株生长及高密度连续发酵的实现作出重要的贡献。通过对B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株的进一步研究发现该菌淀粉酶酶活是出发菌株的5.58倍，补料后淀粉酶活达到690 U·mL－1，由此可知spoIIE基因是克劳氏芽孢杆菌淀粉酶生成的重要相关基因，该发现对高产淀粉酶芽孢杆菌类微生物的构建具有一定的指导意义。