宣威火腿加工过程中抗氧化肽活性变化规律

邵靖萱，高晓格，王雅楠，杨子懿，邢路娟，周光宏，张万刚

(南京农业大学肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏南京210095)

天然抗氧化剂主要是指从蔬菜和水果中提取出来的具有抗氧化活性的物质，它能帮助捕获并中和自由基，从而抑制自由基对人体的损害。其因抗氧化能力相对较高、副作用小，且具有防腐保鲜作用而得到了广泛关注［1－2］。因此，天然抗氧化剂的开发、研究和利用在食品加工工业领域有非常重要的意义。

天然抗氧化剂在自然界分布很广泛，蔬菜、水果、谷物类、油料作物种子、豆科植物、饮料、可可产品、香辛料以及中草药等［3］，均是人类可从饮食中摄取的主要的天然抗氧化剂的来源。近来在天然抗氧化剂的研究中发现，宣威火腿在加工成熟过程中会产生大量的由蛋白质和脂肪降解成的小分子风味物质［4］，其中肌肉蛋白质经内源酶降解后可形成不同分子质量大小的多肽片段，这些多肽不仅赋予火腿良好的感官风味，而且部分多肽具有抗氧化和抗高血压的功效［5－6］。对于宣威火腿的研究，目前主要集中在风味物质的形成与鉴定、加工工艺的优化与标准化、加工过程中蛋白质和脂肪降解及菌落微生物的生成与测定等方面［7－9］，对其中可能含有的抗氧化活性物质等方面的研究还处于探索阶段。

本实验分别对加工前期(加工2个月)、中期(加工4个月)、后期(加工6个月)和加工成熟(加工8个月)的宣威火腿进行粗肽的提取，并以DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率及总抗氧化能力的评价粗多肽的抗氧化活性。为进一步探究火腿加工过程中功能多肽的抗氧化活性变化规律，为火腿中粗肽的有效提取、合理开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

上盐后未加工的宣威火腿以及加工时间分别为2、4、6、8个月的宣威火腿 均购于云南省宣威市浦记火腿食品有限公司;所选用的该公司宣威火腿的加工过程包括腌制、洗腿、晾晒、整形、发酵、干燥成熟等步骤，历时8个月;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)、吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)、还原型辅酶(NADH) 上海源叶生物科技有限公司;还原型谷胱甘肽(GSH) 上海晶纯生化科技股份有限公司;总抗氧化能力试剂盒 南京建成试剂公司;邻苯二甲醛、十二烷基硫酸钠(SDS)和β－巯基乙醇均 均为分析纯，国药集团化学试剂公司;胰酪蛋白胨 分析纯，美国sigma公司;其他试剂 南京建成试剂公司，均为分析纯。

GM200刀式研磨仪 德国Retsech公司;T25匀浆机 德国IKA公司;121550 PMMA冷冻干燥机 德国Christ公司;Spectral Max M2e多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;TW20水浴锅 德国优莱博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗肽粉的提取 参考邢路娟等［10］的方法并略做改进。取每个加工时期的各3条火腿的后腿肉，切成约1 cm3的火腿于3000 r/min离心并斩拌3次，每次10 s，称取斩拌好的20 g火腿肉于100 mL 0.01 mol/L的盐酸缓冲溶液中匀浆4次，每次10 s，转速为16000 r/min，匀浆后于 4℃静置 2 h，再于12000 r/min，－4℃转速下离心20 min，取上清液加入3倍体积的40%(体积分数)乙醇溶液，于4℃静止12 h后，再次于12000 r/min，－4℃下离心10 min，取上清液用45μm滤膜抽滤，抽滤后在－80℃冰箱中预冻12 h后用冷冻干燥机在－80℃下冷冻干燥，得到的粗肽粉保存在－20℃用于分析试验。

1.2.2 粗肽含量的测定 参考Church等［11］的方法并稍作改进。取不同时期粗肽分别溶于水中配制1 mg/mL粗肽液，取100μL粗肽液与2 mL的邻苯二甲醛混合溶液混合，室温下避光精确反应2 min，于340 nm处测定紫外下吸光值。用胰酪蛋白胨作为标准物配制梯度溶液并测定吸光值，绘制标准曲线(y=0.7915x+0.0446，R2=0.9998，线性范围为 0.2～1.0 mg/mL)以由此计算粗肽液中粗肽含量。

邻苯二甲醛混合溶液配制:取80 mg的邻苯二甲醛溶于2.0 mL甲醇溶液，依次加入50 mL 100 mmol/L硼砂(十水合四硼酸钠)溶液、5.0 mL 20%质量分数的十二烷基硫酸钠(SDS)和200μLβ－巯基乙醇，用去离子水调至总体积为100 mL。

1.2.3 DPPH自由基清除率的测定 参考Brandwilliams等［12］的方法并适当修改。取5个时期粗肽溶解于水中配制0.5 mg/mL的粗肽液，以相应质量浓度GSH作为对照。取0.5 mL的粗肽液，加入0.5 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液(体积分数为90%的乙醇配制)，充分混匀后于避光反应30 min。在517 nm下测量混合溶液吸光值，用90%乙醇代替粗肽液作为对照，0.5 mL 90%乙醇与0.5 mL去离子水混合作为空白。按照下面公式计算DPPH自由基清除率:

式中:A1为待测样品吸光度;A2为对照样品吸光度;A0为空白样品吸光度。

1.2.4 超氧阴离子自由基清除率的测定 参考Sakanaka等［13］的方法并适当修改。取5个时期粗肽溶解于水中配制5 mg/mL的粗肽液，以相应质量浓度GSH作为对照。取1.5 mL的待测粗肽液，依次加入 0.5 mL 300 μmol/L NBT、0.3 mL 468 μmol/L NADH及0.5 mL 60μmol/L PMS，所有试剂及样品用50 mmol/L p H8.0 Tris－HCl缓冲溶液配制，混匀后置于25℃水浴5 min，于560 nm波长下测定吸光值，以缓冲液代替样品作为对照，按照下面公式计算超氧阴离子的清除率:

式中:A1为待测样品吸光度;A2为对照样品吸光度。

1.2.5 羟自由基清除率的测定 参考Zhu等［14］的方法并作适当修改。取5个时期粗肽溶解于水中配制5 mg/mL的粗肽液，以相应质量浓度GSH作为对照。取0.6 mL 5 mmo/L邻二氮菲溶液加入0.4 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液，充分混匀后加入0.6 mL粗肽液及0.6 mL pH7.4的EDTA二钠盐，加入0.6 mL 5.0 mmol/L FeSO4溶液及 0.8 mL 0.1%H2O2，混匀后于37℃水浴，避光反应1 h后测定其在536 nm处的吸光值，以去离子水代替样品作为损伤管，以去离子水代替H2O2作为未损伤管。按照下面公式计算粗肽液对羟自由基的清除率:

式中:A1为待测样品吸光度;A2为未损伤样品吸光度;A0为损伤样品吸光度。

1.2.6 总抗氧化能力的测定 取5个时期粗肽溶解于水中配制5 mg/mL的粗肽液，以相应质量浓度GSH作为对照，按照总抗氧化能力(T－AOC)试剂盒的方法进行测定。

1.3 数据分析

统计分析采用SAS软件完成，用方差分析中的线性模型来分析单因素加工时间对火腿中多肽的抗氧化活性影响，采用最小显著差法(LSD)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同加工时期宣威火腿多肽含量

由图1可知，在加工过程中，宣威火腿中多肽的含量总体呈上升趋势。未加工时的肽含量(1.58%)显著低于加工2个月后的肽含量(3.65%)(p＜0.05)。加工2个月至6个月期间多肽含量呈现升高的趋势，但三个加工时期之间多肽含量无显著性差异(p＞0.05)。加工至8个月时，肽含量(6.26%)再次出现明显提升，显著高于6月的样品(4.12%)(p＜0.05)，且极显著高于未加工时的肽含量(p＜0.01)。本次实验加工8个月样品多肽含量(6.26%)为邢路娟等［10］用磷酸缓冲液提取的多肽含量的1.82倍，是Zhu等［14］用相似方法提取金华火腿粗肽的5.39倍。这可能是因为宣威火腿中的多肽含量高于金华火腿，且盐酸提取法比磷酸提取法提取效率高。本实验中未加工的火腿中也存在少量抗氧化活性多肽，这与Escudero等［15］猪肉中具有可抑制ACE活性多肽的研究结果相似。肽含量在0～2个月和6～8个月有显著提升，这可能与火腿中内源蛋白酶的活性有关。加工0～2个月期间，火腿中的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白先在内源蛋白酶(主要是组织蛋白酶和钙蛋白酶［16］)的作用下水解为大分子量的多肽［17］，随后在蛋白酶的作用下(如二肽基肽酶［18］)使多肽分子的氨基末端的小分子多肽以及游离氨基酸释放。Zhou［19］等在金华火腿的研究中发现，加工6～8个月期间，火腿中组织蛋白酶L的活性较之前有明显提升，该酶具有将火腿中不溶性蛋白水解为可溶性蛋白，可溶性蛋白水解为多肽的重要作用。宣威火腿的加工过程中可能存在类似机理，使得肽含量在该阶段显著提升。

图1 宣威火腿在加工过程中多肽含量变化Fig.1 The peptide content changes of Xuanwei ham during processing注:不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(p＞0.05)。不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)，相同大写字母表示差异不极显著(p＞0.01)。

2.2 不同加工时期宣威火腿粗肽液清除DPPH自由基能力

由图2可知，宣威火腿粗肽液在加工过程中具有较好的清除DPPH自由基的能力，且总体呈上升趋势，但始终显著低于同浓度的谷胱甘肽(GSH)(p＜0.05)。在加工前4个月，清除能力变化不显著(p＞0.05)。加工6个月时，清除率较之前有显著提高(p＜0.05)。而6个月之后DPPH清除能力趋于稳定，8月(18.84%)与6月(19.00%)之间无显著性差异(p＞0.05)。本实验宣威火腿DPPH自由基清除率与郑锦晓等［17］报道的金华火腿DPPH自由基清除率相近(均在20%左右)，但是却低于邢路娟等［10］测定的宣威火腿粗肽DPPH自由基清除率(约为60%)。结果不一致主要是因为火腿样品的加工时间存在差异，邢路娟实验所用火腿为加工成熟后16个月的样品，即使在加工成熟后，火腿蛋白质仍会发生进一步的降解，产生更多具有抗氧化活性的多肽，使粗肽DPPH清除能力增强。杨小幸等［20］在苹果酵素天然加工过程中观察到类似现象，DPPH自由基清除率呈先升后降趋势。粗肽液中含有暴露的氨基酸侧链基团，对DPPH可以产生亲和能力。同时，不同加工阶段的降解产生的肽序列有所不同，这也可能导致清除能力的变化［21］。Leticia 等［22］研究发现，在加工成熟西班牙干腌火腿中，抗氧化活性最高的多肽氨基酸序列为Ser－Asn－Ala－Ala－Cys，而 Asp－Leu－Glu－ Glu 为加工成熟后宣威火腿中主要的抗氧化肽片段［23］。

图2 宣威火腿粗肽液DPPH自由基的清除率Fig.2 The scavenging effect of crude peptides from Xuanwei ham on DPPH radical注:不同小写字母表示不同加工时期粗肽液间差异显著(p＜0.05);图3～图5同。

2.3 不同加工时期宣威火腿粗肽液清除超氧阴离子自由基能力

由图3可知，随着加工时间的延长，宣威火腿粗肽液清除超氧阴离子自由基能力有所增强，且始终显著高于同浓度GSH(p＜0.05)。加工前2个月，清除率有明显的提升，加工2个月后的样品自由基清除率(87.80%)显著高于未加工(82.01%)样品加工(p＜0.05)。从2月至6月，清除能力基本保持稳定。加工6个月后，清除能力再次出现较为明显的提高，但变化幅度小于最初2个月，其中8月(87.33%)自由基清除率显著高于6月(90.52%)(p＜0.05)。邢路娟等［10］对宣威火腿的研究表明，同等质量浓度下，宣威火腿粗肽液清除超氧自由基能力极显著高于GSH(p＜0.01)，与本研究结果一致。清除能力在两个阶段出现明显变化，这与宣威火腿不同加工时期多肽含量的变化趋势相一致。祝超智等［28］对金华火腿的研究表明，抗氧化活性的高低与肽链长短也有密切关系，分子量小的肽段具有更强的生物活性。由于大分子肽在发酵过程中不断降解，加工6～8个月内具有抗氧化活性的小分子肽含量可能大幅提升。肽链变短，某些特定基团也具有更多的暴露机会，如具有清除能力的酚羟基团［15］。该基团可以提供氢离子，中止活性氧的链反应，起到清除超氧阴离子自由基的作用。

图3 宣威火腿粗肽液对超氧阴离子自由基的清除效果Fig.3 The scavening effect of crude peptides from Xuanwei ham on superoxide radical

2.4 不同加工时期宣威火腿粗肽液清除羟基自由基能力

羟基自由基是由体内Fenton反应产生的氧化活性最强的自由基，在生理和病理学研究中具有重要意义［25］。由图4可知，宣威火腿粗肽液清除羟基自由基的能力随着加工时间的延长稳步提升。加工最初2个月清除率升高速度最快，提高了13.36%。之后升高速度逐渐趋于缓慢，于加工8个月后达到最高值35.35%。原料肉粗肽液的清除能力与同浓度GSH相差31.63%，有显著差异(p＜0.05)，加工8个月后，两者之间的差异缩小为7.54%。本实验研究中，火腿粗肽的清除能力受加工时期影响变化最大，说明长时间加工可显著提高火腿中粗肽清除羟自由基的能力。但是加工8个月后的粗肽清除羟自由基的能力小于金华火腿中粗肽的清除能力［14］，可能是不同火腿中清除羟自由基的特异性多肽种类或含量不同。范远景等［26］在花生肽的研究中发现，多肽的氨基酸组成和种类对其清除羟基自由基的能力有显著影响。含有Tyr和His等氨基酸的多肽具有较强的抗氧化能力。Tyr是一个潜在的供氢体，His的咪唑基可以有效清除脂游离基和螯合金属离子。随着加工时间的增长，新降解产生的短肽可能含有更多此类氨基酸，从而能更有效地终止羟基自由基的链反应，起到清除作用。

图4 宣威火腿粗肽液对羟基自由基的清除效果Fig.4 The scavenging effect of crude peptides from Xuanwei ham on hydroxyl radical

2.5 不同加工时期宣威火腿粗肽液总抗氧化能力变化

总抗氧化能力可以全面地反应机体防御系统的抗氧化能力［27］，本文用 ABTS快速法，以 Trolox标准液做参比，衡量样品总抗氧化活性。由图5可知，宣威火腿粗肽液的总抗氧化能力总体呈上升趋势，但始终显著低于同浓度GSH(p＜0.05)，与郑锦晓等［17］的实验结果相似，与不同加工时期多肽含量变化趋势相同，加工最初2个月与最后2个月出现了更为显著的变化。从开始加工到加工2个月，总抗氧化能力差异显著(p＜0.05)，由4.20 U提升至4.35 U。之后4个月处于相对稳定状态，三个时间点之间无显著性差异(p＞0.05)。从6月到8月，总抗氧化能力再次出现显著增长，最终在加工8个月达到最大值4.41U(p＜0.05)。郭利娜等［28］对枯草芽孢杆菌发酵小米糠抗氧化活性的研究发现，在一定时间范围内，随着发酵时间的延长，蛋白酶活力与总抗氧化能力显著相关。因此，粗肽液抗氧化能力的变化可能与加工过程中蛋白酶活力的变化相关，火腿中的蛋白质不断被水解成具有抗氧化活性的多肽，总抗氧化能力随之提升。

图5 宣威火腿粗肽液的总抗氧化能力Fig.5 The total antioxidant capacity(T－AOC)of crude peptides from Xuanwei ham

3 结论

本实验探究了宣威火腿加工过程中多肽含量的变化，运用多个指标对宣威火腿中多肽在不同加工时期的抗氧化活性进行评价。随着加工时间的不断增长，宣威火腿中多肽的含量，多肽液清除DPPH自由基能力，清除超氧阴离子自由基能力，清除羟基自由基能力和总抗氧化能力与加工前相比均有不同程度提高，可见长时间加工可以提高火腿中多肽含量和抗氧化能力。同时，宣威火腿对不同自由基的清除效果有较大差异，其中以清除超氧阴离子自由基的效果最为显著，具有成为天然抗氧化剂的应用潜力。本实验结果为火腿中粗肽的有效提取、开发和应用提供了理论依据，为干腌火腿产品营养品质特性提供了参考。