HBV前C区A1896基因突变的探讨及临床用药研究

王 涵，郭志钢

（1.长春中医药大学附属医院检验科，长春 130021；2.吉林大学中日联谊医院神经外科，长春 130033）

乙型肝炎由乙肝病毒（HBV）引起，属于嗜肝病毒，这种病毒喜欢在肝脏中生存，或者说肝脏适合它生存下来，并“繁衍后代”，有的专家形象地称乙肝病毒为“肝细胞的寄生虫”。乙型肝炎病毒（HBV）是一种很小的病毒，它属于嗜肝脱氧核糖核酸（DNA）病毒组中的一个成员。病毒颗粒由外膜和内核两部分组成，完整的HBV颗粒是直径42 nm的球形颗粒，其外膜厚7 nm，由蛋白质和膜脂质组成，称作乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。由于其最早在澳大利亚发现，所以曾被称为“澳大利亚抗原”，简称“澳抗”。中心部分的直径约28 nm，为病毒的核心，其中包括核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg），内核中心含有病毒基因（DNA）和DNA多聚酶。慢性乙型肝炎是指乙肝病毒检测为阳性，病程时间较长或有慢性肝炎表现者。根据乙肝病毒e抗原分为乙肝病毒e抗原阳性和乙肝病毒e抗原阴性的慢性乙型肝炎。近年来临床上越来越多的研究发现乙肝病毒e抗原阴性的慢性乙型肝炎患者乙肝病毒脱氧核糖核酸（HBV DNA）载量很高。HBV-DNA即是乙肝病毒的脱氧核糖核酸,其两链长短不一，长链（L）完整，为负链，长度恒定，约3 200个核苷酸。短链（S）为正链，长度可变，约为长链长度的50～100%，链的增生按5′-3′顺序进行。在不同分子中短链3′端的位置是可变的，而短链和长链的5′端位置固定点为粘性末端，通过250～300个核苷酸碱基配对，以维持DNA分子的环状结构。在粘性末端两侧，两链5′端各有一个由11个bp组成的直接重复序列（Direct repeat DR）-5′TTCACCTCTCC，该DR位于第1824个核苷酸者称DR1，位于第1590个核苷酸者称DR2，在病毒复制中起作用，HBV-DNA阳性提示病毒复制活跃。核苷（酸）类似物主要是抗病毒，提高免疫及恢复肝功，具有不良反应少等优势，在临床上被广泛用来抗病毒治疗[1]。由于核苷类似物可以抑制乙肝病毒复制的转录环节，并无直接清除作用，就需要长期的用药[2]。实验对慢性乙型肝炎e抗原阴性的患者做A1896位点变异检测与临床用药进行观察研究。

1 材料与方法

1.1 病理资料及标准 所有标本均来自长春中医药大学附属医院住院患者。选取慢性乙型肝炎患者230例且乙肝病毒e抗原阴性，排除药物性、酒精性、自身免疫性和代谢性肝病。

1.2 仪器与实验方法 荧光定量PCR测定仪；贝克曼DXI800； 电化学发光方法检测乙型肝炎；荧光定量PCR检测HBV-DNA；荧光定量PCR检测HBV1896位点变异。

1.3 PCR扩增 实时荧光技术对核酸进行定量检测，核酸提取开始加入内标，内标经过核酸提取后进行PCR扩增。

1.4 结果判定 待测样品在混合液A检测Ct值≤38，混合液B为阴性，判断待检样品为HBV1896变异型，如果Ct值在38～40之间，重复检测一次，如果Ct值仍在38～40之间，则判断为阴性。

1.5 统计学方法 样本均数比较采用t检验，率的比较采用χ2检验，P值取双侧，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙肝病毒e抗原阴性的患者体内病毒复制情况 在230例患者中HBV-DNA阳性的有168例，占总人数的44.2%，阳性以HBV-DNA＞102copies/mL为标准，见表1。

2.2 HBV-DNA的滴度与A1896位点变异情况分析 依据病毒含量进行分组，研究显示病毒载量与A1896位点的变异存在一定的关系，病毒载量在5×106及以上时，变异率越高,差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 乙肝病毒e抗原阴性病毒载量分析

表2 病毒载量与变异情况分析

2.3 核苷类抗病毒药物治疗A1896位点变异疗效的分析 本实验应用3种核苷类抗病毒药物对1896位点变异和未变异的患者进行疗效判断，观察其单药用药时间为3～6个月的疗效。研究发现，恩替卡韦变异组治疗效果显著（P＜0.05），见表3。

表3 单药治疗变异组与未变异组的比较

3 讨论

乙型肝炎病毒侵入机体后，在肝细胞内进行复制繁殖。乙型肝炎病毒基因组DNA在肝细胞核内进行复制，转录，在合成核心颗粒后，被转运到肝细胞浆内，在通过内质网和细胞膜时合成其外壳部分，并以发芽的形式释放出肝细胞。实验发现乙肝病毒e抗原阴性不代表患者病毒停止复制，需要做病毒载量的检测。Pollicino等对40例乙型肝炎患者的检测研究中发现基因突变对乙肝的复制能力无影响[3]，与本实验结果相符。慢性乙肝病毒感染的过程比较复查，需要经历四个时期[4]，乙型肝炎感染的各期是否与病毒载量存在相关性影响，将进行下一步研究。人体感染乙型肝炎病毒后，可引起细胞免疫及体液免疫应答，并激发自身免疫反应及免疫调节功能紊乱，致使病变的肝细胞产生或释放大量正常或异常的蛋白质，进一步促使免疫损害加重，使病情不断发展。核苷类似物治疗A1896位点变异的慢性乙型肝炎患者时，恩替卡韦的疗效显著。对慢性乙型肝炎期患者，A1896位点突变应尽快接受治疗，包括抗病毒、免疫调节、抗炎、改善肝功能和抗肝纤维化治疗等，但关键是抗病毒治疗。其目标是最大限度地长期抵制或消除HBV，减轻肝细胞炎症及其所致的肝纤维化，延缓疾病进展，减少肝硬化，原发性肝癌及其并发症的发生，从而延长病人的生存时间和生活质量。目前，乙肝的抗病毒治疗已经有了大幅的进展，但受病毒的变异、人体免疫耐受等因素的影响，容易产生耐药性，故研制高效低毒的抗病毒药势在必行。