槜李叶片DNA提取方法探讨

李白，李军，王蕾，种高军*

(1.嘉兴市农业科学研究院，浙江 嘉兴 314016； 2.嘉兴职业技术学院 农业与环境分院，浙江 嘉兴 314036)

槜李是蔷薇科(Rosaceae)李属(PrunusL.)植物中栽培中国李(PrunussalicinaLindl.)的一个品种群，原产于浙江省嘉兴市，桐乡槜李于2011年获农产品地理标志保护登记[1]。槜李果实熟透后果肉化成浆液，有酒香味，品质上乘，经济价值高[2]。提取高质量的植物基因组 DNA 是有效开展分子育种、品种鉴定、基因功能研究等分子生物学研究的前提[3-4]。槜李为多年生木本植物，体内富含酚类、色素、多糖等物质，这给其DNA提取带来困难，其中多糖污染是DNA提取中最常遇到的问题[4-7]。多糖污染的DNA较黏稠，呈胶状，不利实验操作，且多糖对后续分子生物学反应体系中的酶活性可能产生抑制作用，影响下游研究[5,7-8]。常规的 DNA 提取方法不能有效除去多糖，提取木本果树DNA质量较差[4,9]。经典的CsCl梯度离心能有效除去木本果树的多糖，获得的DNA纯度高，但CsCl梯度离心设备费用高昂，操作不便，且DNA得率低，应用范围有限。随着分子标记等分子生物学技术的发展，实验样品数量快速增长，DNA提取方法应考虑对实验人员与环境的安全，并适用于批量提取大量样品，且尽量避免使用有害试剂[10-11]。本研究报道了一种适用于槜李叶片高质量基因组DNA提取的方法，为槜李等富含多糖的木本果树叶片的基因组DNA提取提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

槜李叶片采自浙江省嘉兴市农业科学研究院古塘基地果树园区，采摘后放入冰盒带回实验室，置于-86 ℃超低温冰箱保存。

1.1.2 试剂

CTAB、SDS、PVP、β-巯基乙醇、EDTA、Tris均购于上海生物工程公司，其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 槜李叶片DNA常规提取

样品处理：取0.1 g槜李叶片转入2 mL离心管中，加入1颗5 mm钢珠，准备12份，经液氮速冻后用震荡破碎仪1 000 r·min-1破碎至粉末状，分4组，每组3管，4组分别用CTAB法、SDS法、高盐法和硅胶膜法提取DNA。

CTAB法：破碎后加入CTAB提取液(100 mmol·L-1Tris，50 mmol·L-1EDTA，1.5 mol·L-1NaCl，2% CTAB，1% PVP，1% β-巯基乙醇，pH 8.0)，65 ℃提取，分别用V(酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)为25∶24∶1和V(氯仿)∶V(异戊醇)为24∶1的溶液抽提上清，用预冷异戊醇沉淀DNA，70%乙醇漂洗2次，风干后加100 μL TE溶解，-20 ℃保存。

SDS法：破碎后加入SDS提取液(100 mmol·L-1Tris，50 mmol·L-1EDTA，0.5 mol·L-1NaCl，2% SDS，1% PVP，1% β-巯基乙醇，pH 8.0)，65 ℃提取，加5 mol·L-1KAc沉淀蛋白等杂质，用预冷异戊醇沉淀DNA，70%乙醇漂洗2次，风干后加100 μL TE溶解，-20 ℃保存。

高盐法：破碎后加入TPS提取液(100 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1EDTA，1 mol·L-1KCl，1% PVP，1% β-巯基乙醇，pH值8.0)，75 ℃提取，上清用预冷异戊醇沉淀DNA，70%乙醇漂洗1次，风干后加100 μL TE溶解，-20 ℃保存。

硅胶膜法：破碎后加入DNA-Silica结合液(100 mmol·L-1NaAc，20 mmol·L-1EDTA，1.5 mol·L-1NaCl，2% CTAB，1% PVP，1% β-巯基乙醇，pH 6.0)，65 ℃提取，取上清加入纯化柱中(含硅胶膜)，静置片刻，离心后弃废液，用70%乙醇冲洗2次，风干去乙醇，加100 μL TE溶解，-20 ℃保存备用。

1.2.2 CTAB法纯化DNA

硅胶膜法提取DNA浓度较低，不做纯化处理。CTAB、SDS、高盐法冻存DNA各取一管，吸取50 μL，加入4 μL 5 mol·L-1NaCl与6 μL 10% CTAB，混匀后离心，沉淀用体积比3∶1的100 μL TE与5 mol·L-1NaCl混合液重悬，加2体积预冷乙醇沉淀DNA，用70%乙醇漂洗2次，风干后加50 μL TE溶解，-20 ℃保存备用[12]。

2 结果与分析

2.1 常规提取方案比较

DNA条带电泳如图1，D值见表1。电泳图中可以看出，CTAB、SDS和高盐法提取的DNA存在弥散条带，点样孔有杂质，根据D值推测，DNA中可能残留一些多糖杂质。硅胶膜法提取的DNA条带亮度低，根据D值推测，DNA浓度较低，可能残留多糖杂质。

C1～3为CTAB法提取DNA；S1～3为SDS法提取DNA；Y1～3为高盐法提取DNA；Z1～3为硅胶膜法提取DNA；M为DL2000 DNA 分子量标准；→为基因组DNA所在位置图1 CTAB、SDS、高盐和硅胶膜法提取 DNA电泳结果

样品浓度/(ng·μL-1)D260/D280D260/D230C1373.1±336.12.10±1.211.86±0.27S1122.9±158.22.13±0.311.66±0.39Y2739.1±256.51.98±0.511.49±0.23Z139.4±13.11.79±0.150.87±0.23

注：C、S、Y、Z分别为CTAB法、SDS法、高盐法、硅胶膜法提取的DNA。

2.2 CTAB纯化效果

纯化后的DNA条带如图2，D值见表2。图中可以看出，CTAB、SDS和高盐法提取的DNA经CTAB法纯化后，RNA、弥散带和点样孔杂质均不同程度减少，根据D值推测，DNA浓度有所降低，这一方面是纯化的损失，另一方面可能是多糖杂等杂质的减少，这些杂质原本具有一定的吸光值。其中高盐提取DNA纯化后下方弥散带增加，可能与原样品杂质含量较高有关。

C为CTAB法提取DNA；Cc为C纯化后产物；S为SDS法提取DNA；Sc为S纯化后产物；Y为高盐法提取DNA；Yc为Y纯化后产物；→为基因组DNA所在位置图2 CTAB法纯化后DNA电泳结果

样品浓度/(ng·μL-1)D260/D280D260/D230纯化前纯化后纯化前纯化后纯化前纯化后C1 099.5731.62.072.151.802.26S990.9465.42.002.071.342.14Y2 558.21 299.51.902.151.402.29

注：C、S、Y分别为CTAB法、SDS法、高盐法提取的DNA。

3 讨论

本研究分别用CTAB、SDS、高盐和硅胶膜4种方法提取槜李叶片DNA，通过DNA浓度、纯度、电泳条带和可操作性评价4种方法。结果表明：CTAB法提取DNA基因组DNA条带完整，有杂带，残留一定RNA和多糖杂质，除蛋白过程需氯仿抽提，操作繁琐；SDS法电泳条带与CTAB法相似，多糖残留较CTAB法多，操作较CTAB法简易；高盐法浓度最高，操作简易，但杂质多；硅胶膜法DNA操作简易，但DNA浓度低，残留多糖杂质。4种方法提取的槜李叶片DNA均存在不同程度的杂质污染，尤其是多糖杂质，这与前人关于果树DNA提取结果的分析一致[4,8,11,13]。

CTAB是一种表面活性剂，能裂解细胞，并能与DNA可逆结合，这种作用受盐浓度影响：当NaCl>1 mol·L-1时，不能形成复合物，DNA呈溶解状态；当NaCl<0.2 mol·L-1时，DNA与CTAB形成复合物，呈沉淀状态；当NaCl在0.3～0.4 mol·L-1时，CTAB与单链核酸结合效率非常低[14]。从实验结果看，用CTAB纯化的DNA产物，能有效去除RNA、弥散带和多糖杂质。DNA提取方法中，CTAB法提取基因组DNA质量也较其他方法好，但过程需氯仿抽提，对实验人员和环境均有危害，且操作繁琐，抽提取上清时易吸到杂质(图1，C2泳道)，不利于批量提取大量果树叶片。

高盐法由高温裂解、低温沉淀和乙醇洗涤3个简单步骤组成，仅需要Tris、EDTA、KCl、异丙醇和乙醇5种常规试剂，操作简便，常用于批量提取大量水稻基因组DNA，且DNA质量较好，便于后续分子实验开展，但用于槜李等富含多糖的植物基因组DNA提取，产物中杂质含量高。

在低pH高盐环境下，DNA的磷酸基团与硅胶膜表面硅烷醇基团之间形成氢键，使DNA吸附在硅胶膜表面，硅胶膜法利用这一特点从细胞裂解液中分离出DNA，绝大多数DNA提取试剂盒采用了这种方法[15]。但受硅胶膜数量限制，结合的DNA总量有限，而且硅烷醇基团会受到一些杂质竞争性结合，并与DNA一同洗脱，一方面降低得率，另一方面杂质含量高，本实验结果也验证了这点，其中杂质从D值推测主要是多糖。

SDS法用SDS裂解细胞释放DNA，因KAc、SDS和蛋白质三者在低温下可形成复合物沉淀，所以用KAc代替氯仿去除蛋白，提取的DNA与CTAB法比较，电泳结果相似，多糖杂质略多，过程未使用有害试剂，操作较CTAB法简单。由于残留多糖可用CTAB纯化法去除，因此可先用SDS法提取槜李叶片DNA，再用CTAB纯化法纯化，以获得高质量基因组DNA。对这种组合提取法可进一步优化，减少操作步骤，更适合批量化提取操作。