分子特征图谱预测肌层浸润型膀胱癌对PD-1/PD-L1抑制剂治疗反应

蔡佳佳，石 达，郭广武，吴 松※

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤[1]。最新的统计数据预估2018年美国新发膀胱癌患者6.2万例，其发病率位于男性癌症的第4位[2]；最新的中国癌症统计学数据显示，2014年中国新发膀胱癌7.8万例[3]。膀胱癌可分为肌层浸润型膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)和非肌层浸润型膀胱癌,其中非肌层浸润型膀胱癌的治疗方式包括经尿道切除术和术后化疗或术后膀胱内卡介苗灌注治疗等[1]。灌注治疗(免疫治疗的一种方式)可降低疾病复发、侵袭和转移的风险[4]。MIBC或转移性膀胱癌的标准治疗方式是根治性全膀胱切除术和盆腔淋巴结清扫术后辅以化疗，对不能从一线化疗中获益或不符合化疗标准的患者可选择免疫治疗的方案[5]。MIBC免疫治疗具备显著有效性、持续反应性和较低毒性的特点[6-8]。程序性死亡受体1(programmed cell death 1,PD-1)与对应的配体——程序性死亡配体1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)结合时可抑制免疫系统，形成肿瘤免疫逃逸的现象[9]。PD-1/PD-L1抑制剂是MIBC患者有效免疫治疗药物之一，能明显延长患者总体生存期，但膀胱癌患者对非精准免疫治疗的客观缓解率仅为15%～21%,大部分患者不能从中受益[6,10-12]。因此，需寻找指导精准免疫治疗的方案提高治疗有效率。近年来，癌症基因组学的发展为实现癌症个性化治疗提供了新方向，人类癌症对药物反应的分子特征也得到补充[13]。现从MIBC患者对PD-1/PD-L1抑制剂反应的分子特征图谱方面进行总结分析。

1 MIBC分子特征图谱与PD-1/PD-L1的关系

肿瘤抗原或被T细胞识别表位的缺乏、肿瘤组织中浸润性T细胞过少和免疫抑制因子增多均可导致免疫治疗失败[14]。免疫系统激活的过程可分为以下7步：①肿瘤细胞抗原产生；②肿瘤抗原的呈递；③免疫系统激活；④T细胞向肿瘤组织趋化；⑤肿瘤组织中出现浸润性T细胞；⑥T细胞对肿瘤细胞识别；⑦T细胞杀伤肿瘤细胞[14]。肿瘤细胞表达的PD-L1与免疫细胞表面PD-1结合而激活的信号通路可抑制免疫活性，导致肿瘤免疫逃逸；PD-1/PD-L1抑制剂通过阻断以上生物过程可增强免疫活性来杀伤肿瘤细胞[15]。PD-1/PD-L1抑制剂治疗MIBC患者是否成功也取决于以上免疫系统激活的7个步骤，其中突变抗原、PD-L1的表达量和γ干扰素的表达量等均可影响免疫治疗效果[16]。通过研究以上因素相关的基因突变和表达情况可间接预测PD-1/PD-L1抑制剂在MIBC治疗中的反应情况[16]。基因组计划产生的大量高通量基因组学的数据促进了膀胱癌分子层面的研究，使膀胱癌分子图谱得到完善，有助于研究者们促进膀胱癌精准免疫治疗的发展[17-18]。

2012年，Sjödahl等[19]根据93例MIBC样本中11种特定基因的RNA表达量将其分为5种亚型，分别为Urobasal A型、Urobasal B型、基因组不稳定型、渗出型和鳞状细胞癌样型；其中浸润型膀胱癌中表现出免疫细胞特征。2014年，Damrauer等[20]根据数据库中MIBC基因表达数据的Meta分析结果将其分为管腔样和基底样两个亚型，研究表明管腔样亚型高表达UPK1B、UPK2、UPK3A和KRT20，而基底样亚型则高表达膀胱癌基底细胞标志物，如KRT14、KRT5和KRT6B；建立的BASE47基因集可将MIBC亚型进行准确分类。Choi等[21]对73例MIBC样本的mRNA数据进行聚类分析，将其分为3个不同的亚型，分别为基底型、管腔型和p53样型，其中p53样型膀胱癌对于大多化疗药物抵抗，且化疗抵抗的样本中均能发现p53样亚型的癌细胞。

2014年癌症基因组图谱研究团队对131例MIBC组织的分子特征(主要包括DNA、RNA、蛋白质)进行探索，将患者DNA突变情况分为A、B、C三个亚型，其中A型为集中扩增型，B型为乳突状CDKN2A缺失-FGFR3突变型，C型为TP53/细胞周期突变型；根据mRNA表达量将MIBC分为4个亚型，分别为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型，其中Ⅰ型和Ⅱ型高表达人表皮生长因子受体2和雌激素受体，为膀胱癌的靶向治疗提供了理论基础[18]。2015年，研究者根据MIBC组织的mRNA表达量、体细胞拷贝数变异和基因突变的综合分型(consensus clusters,CC)将其划分为CC1型、CC2型和CC3型三个亚型；研究发现该分型与其他分型的亚型具有相似的特征，如CC3型与基底型和管腔型具有相似的特征[22]。

2017年，Robertson等[17]则根据408例MIBC的mRNA数据将其分为5种不同的亚型，即管腔-乳头状型、管腔渗透型、管腔型、基底状/鳞状型和神经元型，同时发现管腔渗透型与2014年定义的Ⅱ型膀胱癌表达特征相似并均对基于顺铂的化疗不敏感,但对免疫检查点抑制剂敏感。另一项研究则发现2014年定义的Ⅱ型转移性或不可手术的膀胱癌患者对atezolizumab(PD-L1抑制剂)敏感[6]。研究表明分子特征图谱展示的信息与癌症的临床病理特征及药物反应相关[10]，根据药物作用靶点和癌细胞基因组学改变情况可针对性地选择癌症治疗有效的药物[17]。因此，疾病分子特征图谱成为辅助指导治疗的新方法，有助于临床医师获得更多基因组学信息并实行精准化医疗。

2 膀胱癌分子特征图谱在PD-1/PD-L1抑制剂治疗中的应用

美国食品药品管理局批准5种免疫治疗药物用于化疗失败或者不符合化疗标准的晚期膀胱癌患者的治疗[6-8]。其中，atezolizumab(PD-L1抑制剂)和pembrolizumab(PD-1抑制剂)已被用作基于顺铂化疗方案无效的晚期或转移性膀胱癌患者的一线治疗方案[23]。同时，另一项研究表明免疫检查点抑制剂治疗的反应性与基因组不稳定性相关[24]。膀胱癌患者的分子特征可能也与免疫治疗应答相关。

2.1基因突变与PD-1/PD-L1抑制剂反应效果的关系

2.1.1特定基因突变对疗效的影响 研究发现超过30%的膀胱癌患者存在非同义突变[25],另一项研究则在膀胱癌中发现多个调控染色体重组的基因突变，如KDM6A、CREBBP、EP300和ARID1A[26-27]。基因组改变不仅可导致癌细胞信号通路发生改变(如p53/Rb细胞周期通路、受体酪氨酸激酶/磷脂酰肌醇-3-激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白增殖通路和组蛋白修饰染色质调控网络)，也会使肿瘤细胞产生新抗原[28]。在肿瘤发生过程中由体细胞突变产生的特异性新抗原已被证明能诱导高度选择性的T细胞应答[29]。突变导致新抗原的产生可激活免疫系统的启动，影响免疫系统激活的第一步[14]。研究表明肿瘤细胞因体细胞突变产生的新抗原与PD-1和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4抑制剂治疗疗效呈正相关[30]。

2.1.2肿瘤突变负荷(tumor mutational burden,TMB)对疗效的影响 TMB是指肿瘤基因组中每个编码区的突变总数,在黑色素瘤和非小细胞肺癌中TMB与免疫检查点抑制剂的应答率相关[24-31]。研究表明TMB高的患者抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4治疗效果更好[32]。一项415例MIBC患者的Ⅱ期临床试验表明TMB不仅与患者的预后相关，也可用于预测atezolizumab的治疗反应效果[6]；同时，另一项374例膀胱癌患者的临床研究也得到了同样的结论。Balar等[7]则用公式表明两者间的关系：客观缓解率=10.8×log(X)-0.7(其中X表示DNA每兆编码区突变数)，该公式可用于预测肿瘤对PD-1抑制剂治疗的反应效果。这些结果提示TMB对免疫治疗反应结局的预测具有一定的应用前景，但关于TMB是来源于全外显子测序还是特定某些基因的测序结果的观点尚未统一，仍需更多样本的前瞻性研究进行探索。

2.1.3高度微卫星不稳定性(microsatellite instability-high，MSI-H)和错配修复缺陷(mismatch repair deficient，dMMR)对疗效的影响 研究表明基因突变率高的患者具有特定DNA损伤反应缺陷，如MSI-H和dMMR[33]。临床试验表明具有MSI-H或dMMR特征的实体瘤患者对PD-1抑制剂的有效率更高[34]。这可能是因为dMMR特征肿瘤表达突变相关的新抗原进而识别肿瘤细胞，并激活抗肿瘤免疫[34]。美国食品药品管理局基于149例实体瘤患者的临床试验结果批准默沙东公司生产的pembrolizumab用于治疗诊断为MSI-H或dMMR的实体瘤患者[35]。5个KEYNOTE试验结果表示具有MSI-H和dMMR特性的人群在经过pembrolizumab治疗后生存期达到6个月甚至更长时间的反应比率达到78%[34]。MIBC、遗传性非息肉病性结直肠和子宫内膜癌疾病的一个重要特征是MSI-H，其中MIBC患者中具有该类特征的概率为5%[36-37]，表明MIBC患者的基因突变特征可用于预测免疫治疗效果。

2.2表达异常与PD-1/PD-L1抑制剂疗效的关系

2.2.1PD-L1表达对疗效的影响 肿瘤细胞可通过表达PD-L1躲避免疫监视进而促进肿瘤的发生发展，PD-L1抑制剂则可阻断该生物过程[8]。在膀胱肿瘤中免疫组织化学实验测量的PD-L1表达与切除术后病理分级增高和病死率增加有关，表明PD-L1的表达可作为预后因素[38-39]。临床试验表明膀胱癌中PD-L1表达量的改变与PD-L1抗体免疫疗效相关[8]，但以此作为评估免疫治疗效果的生物标志物存在一些难以解决的问题：①检测样本时使用的实验方法不同。如在检测nivolumab(PD-1抑制剂)疗效的临床试验中使用Dako实验检测PD-L1的表达量，但是在durvalumab(PD-L1抑制剂)的临床试验中则使用Ventana实验方法检测其表达量[40]。②检测过程中使用的抗体不同。一项针对90例非小细胞肺癌队列的研究中，比较22C3、28-8、SP263和SP142抗体检测PD-L1的表达量，发现肿瘤细胞和免疫细胞使用SP142抗体检测时得到的PD-L1表达量最少[41]。③检测样本的组织来源不同。在一项研究中，研究者选择免疫细胞表达的PD-L1作为肿瘤组织PD-L1的表达量[42]，而另一项研究检测PD-L1的表达量却来源于肿瘤细胞[43]。④肿瘤组织内PD-L1的表达量存在异质性，非小细胞肺癌检测PD-L1表达量时，检测肿瘤组织的不同部位得到的结果相差近25%[44]。这些研究表明PD-L1的检测结果受实验方法、抗体、组织来源和瘤内异质性的影响。

除此之外，关于PD-L1表达阳性的定义也尚未统一，部分研究者认为若有5%以上的肿瘤组织表达PD-L1则为PD-L1表达阳性[45]，而另外一些研究者则定义12%以上膀胱癌细胞表达PD-L1才为PD-L1阳性[39]。为解决实验方法带来的检测结果误差，Huang等[46]通过检测PD-L1信号通路mRNA的表达量来取代免疫组织化学方法检测PD-L1蛋白表达水平。该研究纳入3个不同的膀胱癌患者的队列，共695个样本，使用微阵列基因表达数据表明PD-L1的高表达导致患者的预后较差。这一研究方法从转录组水平对PD-L1的表达进行定量，避免了利用免疫组织化学方法所致的检测结果不稳定。

使用PD-L1状态作为预测的生物标志物只参考了肿瘤微环境的一个因素，但肿瘤微环境还受很多其他因素影响[47-48]。Ock等[49]根据CD8A和PD-L1的表达量将肿瘤微环境免疫类型分为4种亚型，与其他亚型相比，CD8A和PD-L1表达量增高的Ⅰ型患者具有更高的TMB和更多的新抗原，这些特征导致其对PD-1和PD-L1抑制剂更加敏感。

2.2.3基因表达谱对疗效的影响 研究表明，基因表达谱是预测化疗和免疫治疗效果的有效生物标志物[52-53]。Rosenberg等[6]将膀胱癌据根据TCGA(肿瘤基因组图谱)的分类方法进行分子分型后，发现该分型与PD-L1拮抗剂治疗效果相关；其中，在基底型膀胱癌中表达PD-L1的肿瘤细胞比重达到39%，而在管腔样膀胱癌中仅为4%；但基底型膀胱癌中PD-L1的表达量增加与PD-1/PD-L1反应性并不呈正相关[6]。与其他亚型相比，经过顺铂治疗的管腔Ⅱ型膀胱癌患者对atezolizumab的反应更加灵敏[6]，可能因为该亚型基因表达特征与活化T细胞表达相关。这一结论在对顺铂治疗耐受的管腔型膀胱癌患者中也得到验证[23]。管腔型可能是潜在的预测膀胱癌亚型对免疫治疗有效的生物标志物，但仍需要更大的样本对这一结论进行验证。

以上研究结果强调了癌细胞、免疫系统和肿瘤微环境之间复杂的相互作用，这一现象在所有类型的癌症中普遍存在，包括MIBC，提示在研究药物治疗反应过程中，对单方面因素进行预判存在结果偏差，故需对多种因素进行综合考虑。

3 结 语

近30年来，关于MIBC的治疗方案尚无重大进展[54]。免疫治疗可延长MIBC患者生存期，疗效具有持续性、低毒性等特点；但不同的患者对PD-1/PD-L1抑制剂的治疗效果不同。因此，MIBC患者需更精确的用药指导。通过对MIBC患者基因突变及表达等分子信息与药物疗效间的关系进行研究及明确MIBC患者的分子特征图谱与PD-1/PD-L1抑制剂疗效间的关系，研究结果表明肿瘤突变抗原、TMB情况、MSI-H或dMMDR特征、PD-L1表达情况、特定基因表达情况和基因表达谱与免疫治疗应答情况相关。因此，根据分子特征图谱针对性选择药物对指导患者进行精准免疫治疗具有一定的意义。

但实现PD-1/PD-L1抑制剂对MIBC患者的精准免疫治疗仍面临一些问题。①目前尚没有准确率特别高的单一生物标志物对药效进行评估，这可能与免疫检查点抑制剂的作用机制相关，免疫应答效果受多种因素的影响，如治疗过程中肿瘤细胞不断发展产生新突变抗原；肿瘤组织内存在异质性；PD-L1检测方式尚未标准化。②获取MIBC患者的分子特征图谱的分析方法尚未统一，准确性最高的分子特征也未达成共识，MIBC的分子特征图谱与MIBC免疫治疗效果间的关系需更大的临床队列进行验证。③特征图谱的准确模式识别有待进一步优化，提高其准确性。通过多种生物标志物对MIBC患者分子特征进行综合评估可提高预测MIBC对PD-1/PD-L1抑制剂治疗反应的准确性，同时也需要扩大临床队列研究对其进行验证，实现对MIBC患者的精准免疫治疗。