三种酶解底物制备的诱食剂的香气分析及适口性研究

宋诗清， 童彦尊， 冯 涛*， 范然然， 喻 晨

（1．上海应用技术大学 香料香精技术与工程学院，上海市 201418；2.安琪酵母股份有限公司 特种酶制剂事业部，湖北省宜昌市443003）

犬粮诱食剂大都以蛋白质酶解液为底物进行美拉德反应获得（易建华等，2016），因此许多针对诱食剂生产的商业复合蛋白酶面世，成为该领域研究的重点之一。风味的好坏是诱食剂产品的命脉，一款风味饱满的诱食剂能极大改善狗粮的适口性。风味呈现并非由某一种或一类的化合物决定，而是相互作用的结果（Kerth等，2015）。在宠物食品方面，香气提取主要采用HS-SPME（Chen等，2017）。电子鼻在食品领域中被广泛运用，可区分不同产品的整体香气差异或检测同一种产品的货架期（Rock等，2008）。电子鼻能将人对风味的捕捉数字化，结合感官评价使风味分析更具科学性。Tian等（2015）将电子鼻与GC-MS联用对牛肉的品质及风味进行了分级和评价。

本试验对三种不同的酶制得的诱食剂进行感官评定、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）和气相色谱-嗅辨仪（GC-O）分析，确定诱食剂的风味特征及关键风味成分。用电子鼻区分三种诱食剂的整体香气差异。采用适口性测试验证三种诱食剂的实际应用效果，体现三种诱食剂风味的优劣。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 诱食剂A、B、C采用不同酶解液做底物的诱食剂；犬粮：上海仕林生物科技有限公司提供；20只试验犬（表1）：上海交大农学院教学实验实习场；2-辛醇 （色谱纯）、烷烃C5-C22（色谱纯）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；二氯甲烷（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。

表1 试验犬信息

1.2 仪器与设备 7890A-5975C型GC-MS 7890A气相色谱仪 （安捷伦科技有限公司）；ODP嗅闻装置 （德国Gerstal公司）；FOX4000电子鼻（法国阿尔法莫斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 感官评价 选5名感官人员对诱食剂进行感官评定，标准如表2所示。

表2 感官评价标准

1.3.2 HS-SPME法萃取香气 准确称取4 g诱食剂，加入20 mL萃取瓶中，在50℃水浴温度下平衡15 min，用老化好的萃取纤维头（50/30μm纤维头：DVB/CAR/PDMS）顶空萃取 40 min，萃取温度为50℃。萃取纤维头解吸5 min，解吸温度为250℃。

1.3.3 GC-MS条件 GC条件：HP-INNOWAX色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气 N2，流量为3 mL/min，不分流；进样口温度250℃；升温程序：45℃保留1 min，以4℃/min升温至230℃，保留15min。

MS条件：采用电子电离源；电离能量70 eV；离子源温度230℃；接口温度250℃；采用全扫描方式；质量扫描范围为m/z 20～350。

1.3.4 SDE法萃取香气 用同时蒸馏装置，取15 mL诱食剂和150 mL蒸馏水混合，温度控制在100～200℃，用二氯甲烷作溶剂，加60mL，萃取3 h。萃取结束后收集提取液，加无水硫酸钠，低温陈化24 h，浓缩至1 mL，加入10μl内标物（0.2mg/ml2-辛醇）。 进样量：0.2 μL，分流比 10∶1，溶剂延迟6min，升温程序不变。

1.3.5 AEDA法分析 用二氯甲烷将浓缩液分别以 1∶3、1∶9、1∶27、1∶81，1∶243 比例稀释，取 2 μL 稀释后样品注射到GC-O装置（GC条件不变），直到评价人员在ODP末端不再嗅闻到气味，记下此时的稀释倍数，并计算FD因子 （Usami等，2013；Choi等，2010）。评价人员需记录从ODP口闻到的气味特性及时间，结果与香气物质的出峰时间匹配，要求至少有两名评价人员（共三人）描述一致。

1.3.6 电子鼻分析 分别称取三种诱食剂各1 g到5mL的样品瓶中，依次放于电子鼻的自动进样器上。采样时间900 s，采样温度60℃，进样针量为2500μL，每个样品重复4次。

1.3.7 适口性测试 犬粮制备：在55℃条件下将诱食剂均匀喷涂在犬粮表面（添加量5%），冷却后得到诱食剂添加粮Aa、Bb和Cc，空白犬粮D作为对照。

动物试验（Aldrich 等，2015）：先以 Aa和 Bb、Aa和Cc做两组比对，选取效果较好的与D比较进行验证；每组持续两天，每天喂2餐（间隔7 h），选20只成年小型犬。每餐同时喂两种犬粮各100 g，喂食持续30 min，记录犬对犬粮的第一口偏好，喂食完毕再记录剩余的犬粮；每次喂食前清洁并固定食具，准备饮用水，每餐需交换食具位置，犬粮不得重复饲喂；试验犬须健康状况良好，无呕吐拉稀状态。

1.3.8 计算公式 用NIST库检索出峰，通过烷烃C5-C22在相同条件下的保留时间，计算挥发性物质的保留指数 （retention index，RI）（Majlát等，1974），将算得的 RI与Wiley 7n.l数据库进行匹配，RI按公式（1）计算：

式中：tx为挥发性物质的保留时间，min；tz为与挥发性物质碳原子数相同的烷烃的保留时间，min；z为烷烃碳原子数。

香气活力值（OAV）等于挥发性物质的浓度与水中的嗅觉阈值之间的比值。挥发性物质浓度按公式（2）计算：

式中：Wi为挥发性物质含量，μg/g；ms为内标物质量，μg；Ai为挥发性物质峰面积；As为内标物的峰面积；m0为浓缩物质量，g。

FD因子即Log3FD，FD为样品的稀释倍数，Log3FD≥3时证明香气物质对香气贡献大（Buttery等，2013）。

采食率/%=消耗的犬粮/总犬粮×100。

1.3.9 数据处理 用SPSSStatistic 19进行方差分析，按Duncan的多范围测试结果具有显著性（P<0.05）。

采用Unscrambler 9.7进行PLSR分析动物试验结果与香气物质间的相关性，模型采用Full Cross-Validation进行校正。

2 结果与分析

2.1 感官评定与比较 三种诱食剂的感官评定结果如表3及图1所示。三种诱食剂均有明显的鸡肉香气，可能由于三款诱食剂都以鸡肝作为反应底物；诱食剂A和B的脂肪感强于C；诱食剂C和A的烤香、焦糖香、酱香和丰满度均强于B，诱食剂B的香气较寡淡；在余味方面，诱食剂C高于诱食剂A和B。通过感官评定初步认为三种诱食剂的特征风味是肉香、脂肪香和烤香。

表3 感官评定结果

图1 诱食剂的感官评价雷达图

2.2 诱食剂的挥发性风味成分分析与比较 三种诱食剂的GC-MS结果如表4所示。在三种诱食剂中共检测鉴定出40种挥发性成分，分别从诱食剂A、B、C中检测鉴定出27种、24种和32种物质，其中醛类、杂环类、醇类物质的种类较多。醛类物质一般由脂肪酸氧化或美拉德反应产生，是诱食剂中脂肪香、烤香的重要来源 （Mottram等，2015）。从三种诱食剂中都鉴定出的醛类物质有2-甲基丁醛、异戊醛、辛醛丙二醇缩醛、菠萝醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛和戊醛丙二醇缩醛。其中2-甲基丁醛、糠醛及菠萝醛能呈现烘烤香气，戊醛丙二醇缩醛能加强诱食剂的油脂感。三种诱食剂的醇类物质种类较少，糠醇具有焦糖香，甲硫醇有强烈葱蒜气息是肉香的重要来源，而2-乙基己醇具有脂肪香。从三种诱食剂鉴定出了低分子量，易挥发的丙位丁内酯，具有奶油特征香气，可增强香气饱满度。从三种诱食剂中鉴定出的酮类物质为呋喃酮，具有焦糖香，可增加香气厚实感。从诱食剂A和B中都鉴定出了1-羟基-2-丁酮和羟基丙酮，提供烤香和焦糖香，可见诱食剂中的酮类物质主要以焦糖香韵为主。酸类物质在诱食剂中的形成一般是通过油脂的氧化等过程（Zviely，2012），仅在诱食剂A中鉴定出乙酸，而酸在诱食剂中主要起调和口感的作用。杂环类物质主要来自于美拉德反应，是诱食剂中形成肉类风味的重要成分（Chen 等，2017；Liu 等，2015），三种诱食剂中均鉴定出2-甲基吡嗪、2-甲基呋喃和2-乙酰基呋喃能提供烤香和焦糖香；三种诱食剂都鉴定出了具有明显肉类特征和葱蒜气息的含硫物质，如二甲基二硫醚是肉香型诱食剂中极为关键的成分，在肉类香精中也十分常见。总体来讲三种诱食剂的主要呈香物质种类较相似。

2.3 诱食剂的特征性挥发性成分定量分析与比较 采用SDE-GC-O从诱食剂A、B、C中鉴定分别出18、17和22种香气活性成分，结果如表5所示，其中甲硫醇、2-甲基丁醛、2-甲基吡嗪、苯甲醛和糠醛等具有较高的FD因子（Log3FD≥3），对诱食剂的香气贡献大。以保留指数为横坐标，以Log3FD为纵坐标绘制FD图谱如图2所示，FD因子较高的成分大多处于靠前的位置即出峰较早，多为小分子物质。为进一步确认诱食剂中关键挥发性成分，通过内标法得到物质含量，并查找这些物质在水中的嗅觉阈值，得到OAV值，通常香气成分的FD因子与OAV呈正相关。如表6所示，三种诱食剂中甲硫醇的OAV值最高，其次为2-甲基丁醛和菠萝醛等。总体来讲，甲硫醇、2-甲基丁醛、菠萝醛、2-甲基吡嗪、糠醛具有较高的FD因子及OAV值，对整体风味贡献大。由此可见三种诱食剂因美拉德配方和工艺相同，关键呈味物质的种类相似，但在含量上有差异。诱食剂A的肉香，脂肪香更突出，诱食剂C烤香更突出，诱食剂B特征香气较淡，故通过引入FD因子和OAV值分析得出关键呈味物质能够区分三种酶解液造成的香气差异。

表4 三种诱食剂的主要挥发性成分

表5 诱食剂A、B、C的AEDA分析结果

图2 诱食剂A、B、C的FD谱图

2.4 电子鼻区分三种诱食剂的风味 电子鼻的雷达图如图3所示，三种样品的轮廓清晰，表明稳定性好。诱食剂A对于LY2/gCTL、LY2/gCT、LY2/AA传感器的吸收度更高，表明诱食剂A中有更多宠物或烘烤类食品挥发出的特征风味物质（Yu等，2012）。诱食剂C的整体雷达轮廓最大，可见其香气最强，与之前GC-MS和GC-O的分析结果相符。

电子鼻的主成分分析 （PCA）结果如图4所示。PCA是通过对原始数据向量进行线性变换来寻找样品间的差异的一种算法，该算法不丢失任何样品信息，仅通过改变坐标轴来达到区分样品的目的。由图可知主成分1（PC1）和主成分2（PC2）共能反映99.988%的信息，证明检测结果可信度高。由于PC1占比94.273%，故主要观察三个样品在横轴上的距离，显示诱食剂A与诱食剂B相似度更高，而A和C的差异性最大。

表6 诱食剂A、B、C中FD因子大于3的香气化合物的OAV值

图3 三种诱食剂的电子鼻雷达图

图4 诱食剂的主成分分析图

2.5 诱食剂对狗粮适口性的改善 由图5可知，诱食剂添加粮Aa与Bb在采食率和第一口偏好上没有显著差异，但Aa的采食率和第一口偏好都优于Bb。表明诱食剂A对狗粮适口性的改善好于B，但不明显。由图6可知，Aa与Cc在采食率上就没有显著差异，但Aa的平均采食率高于Cc，而Aa的第一口偏好数显著高于Cc，表明诱食剂A在对犬粮香气改善明显。选取Aa与空白粮D进行对照做验证，结果如图7所示，Aa的采食率和第一口偏好都显著高于D。该组试验中，试验犬对Aa的第一口偏好次数占比82.5%，平均采食率达64%，验证试验表明诱食剂能显著改善犬粮的适口性。

图5 Aa和Bb采食率和第一口采食偏好的比较

图6 Aa和Cc采食率和第一口采食偏好的比较

图7 Aa和D采食率和第一口采食偏好的比较

利用Unscrambler v9.7做PLSR分析动物试验结果与呈香物质之间的相关性，以GC-MS检测得到的风味物质含量为X变量，诱食剂的应用效果（第一口偏好和采食率）为Y变量，如图8所示，两椭圆分别表示50%和100%的方差贡献率。由图中红框区域可知，糠醇（焦糖气息）、糠醛（杏仁香）、苯甲醛（苦杏仁香）、丙位丁内酯（奶香、果香）、乙酸（刺激性酸味）、2-乙基己醇（脂肪香）、甲硫醇（葱蒜味、肉香）、菠萝醛（烤土豆）、硫醇（肉香、烤香）、戊醛丙二醇缩醛（脂肪香）、5-甲基呋喃醛（焦糖香）和5-甲基-2-噻吩醛（杏仁香）与第一口偏好和采食率相关性较好，且以上这些物质在诱食剂A中含量更高，与AEDA分析结果相符。这体现出肉香、烤香、脂肪香和酱香更协调且能提供犬类偏爱的酸味口感的诱食剂对犬的吸引力更大（Frantz，2011），能有效提升狗粮的适口性。

图8 动物试验结果与风味物质间的相关性

3 结论

通过感官评定得出三种诱食剂的主体风味是肉香、烤香和脂肪香，诱食剂A的肉香较突出且香气协调性更好，风味更宜人，而诱食剂C的烤香较突出。通过HS-SPME-GC-MS分析，从3种诱食剂中共鉴定出40种风味物质，以醛类、杂环类和醇类为主，具有肉香、烤香和脂肪香的风味特征。采用SDE-GC-O技术鉴定出了甲硫醇、糠醛、菠萝醛、2-甲基吡嗪等有较高的FD因子和OAV值，对整体风味贡献大，其中甲硫醇最突出，是肉香重要来源。诱食剂A的关键香气物质的OAV较高，但烤香成分如2-甲基丁醛和2-甲基吡嗪的OAV低于诱食剂C，这与感官评价结果相符。采用电子鼻辨别三种诱食剂的差异，由PCA分析得出三种诱食剂差异较明显，显示不同酶对诱食剂风味有影响，诱食剂A和B更相似，与C区别较大。动物试验结果显示诱食剂添加粮Aa的第一口偏好与采食率均高于Bb和Cc，表明诱食剂A对狗粮风味的改善效果较好，而Aa的采食率和第一口偏好都显著高于空白粮D，表明以肉香和烤香为主体的诱食剂能显著改善狗粮的适口性。采用PLSR分析风味物质与第一口偏好及采食率的相关性，得出直接影响诱食剂风味优劣的主要几种风味物质成分有糠醇、糠醛、苯甲醛、丙位丁内酯、乙酸、2-乙基己醇、甲硫醇、菠萝醛、硫醇、戊醛丙二醇缩醛、5-甲基呋喃醛和5-甲基-2-噻吩醛，与AEDA分析结果相符。