生物法降解黄曲霉毒素B1的机理研究进展

黄 巍， 殷海成， 王 乐

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

黄曲霉毒素B1（AFB1）主要由两大类丝状真菌：黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，属于一种二呋喃香豆素（二氢呋喃氧杂萘邻酮）的衍生物（Abrar等，2013）。因其在紫外照射下会产生蓝色荧光而得名。AFB1是目前为止发现的真菌毒素中毒性最强、最稳定的毒素，其基本毒性单位为二呋喃环，尤其是氧杂萘邻酮的结构具有极强的致畸和致癌作用，常规的高温和强酸条件难以将其降解，只有在温度为268～269℃、pH 1.0～3.0时少量降解，但对于碱性溶液抵抗力较弱，pH 9.0～10.0条件下迅速分解。此外，AFB1易溶于甲醇、氯仿、乙腈、丙酮等，但不溶于水。

黄曲霉对农作物如玉米、花生、小麦等具有很强的侵染性，可以发生在作物的生长、收获以及果实储藏、运输等过程。这些被黄曲霉侵染的作物果实如被加工成动物饲料，不仅不能被消除，反而还会被放大，甚至进一步对动物及其产品造成二次污染（Oruc 等，2006）。可见，AFB1的污染不仅是食品、饲料工业而且是动物产品加工行业亟待解决的重要问题。所以必须采取有效的防控措施降解或消除AFB1带来的食品安全问题。

目前，常用的降解AFB1方法有物理法、化学法和生物法，其目的是将AFB1脱除或转化为无毒化合物（戴军，2015）。如表1所示，这三种脱毒方法在一定程度上可以降低或者消除部分AFB1的毒性。但采用理化法脱毒，不论是单独使用或者联合使用都难以达预期的安全、高效、低成本和不破坏营养成分等效果；而采用生物法降解AFB1具备高效、清洁、低成本、稳定、作用范围广泛、解毒彻底等优点，表现出独有的优势和广阔的研究前景。

表1 黄曲霉毒素B1脱除方法比较

1 生物法降解AFB1的方式

生物法降解AFB1已经逐渐成熟，大多数研究者拟先通过高通量筛选出解毒效率高的优势菌株，或者在原有菌种的基础上进行物理化学诱变、定向进化和基因工程改造等方法提高原始菌株的解毒效率；其次通过分离纯化具有降解AFB1的微生物分泌的酶等物质，并通过分析经微生物降解后的产物化学结构，从而探讨微生物降解AFB1过程和机制。

1.1 微生物对黄曲霉毒素B1的吸附作用 自然界有许多微生物可通过非共价方式与AFB1结合，形成菌体-AFB1复合体，形成的复合体中微生物吸附性能减弱，整体趋于稳定，不易被动物机体吸收而排出体外，从而降低AFB1对动物的危害（Lee 等，2003）。 刘畅等（2010）利用酿酒酵母 Y1（Y1）高效吸附AFB1，其吸附率高达81.16%。杨玉红（2009）对AFB1进行乳酸菌吸附时发现，干酪乳杆菌干酪亚种CGMCC 1.539（L.casei CGMCC 1.539）对AFB1具有较好的吸附作用，吸附效果为49%。酵母菌和乳酸菌吸附AFB1被认为是具有开发利用价值的微生物。酵母菌和乳酸菌的细胞壁上存在与AFB1结合位点。例如，酵母菌的细胞壁上的葡聚糖成分在吸附AFB1的过程中起到关键的作用，主要在于葡聚糖的螺旋状分子结构与AFB1的特异性互补结合（杨乃欢等，2009）；此外酵母细胞表面的甘露聚糖和几丁质等也提升其吸附能力。张秀江等（2016）将酵母菌、酵母细胞壁和水和铝硅酸盐结合，制备酵母霉菌毒素降解剂，探讨其对饲料中AFB1的脱毒效果。研究发现，当加入浓度为0.25mg/mL的降解剂时，对AFB1的吸附率最高，为98.21%。钱潘攀等（2017）采用麝香草酚诱导酵母细胞裂解，使β-葡聚糖的含量增加51.5%，提升对AFB1的吸附效果，其吸附能力达2.5μg/mg。乳酸菌细胞壁表面的肽聚糖也具有极强的吸附AFB1作用。姜富贵等（2018）和Moretti等（2018）利用植物乳杆菌（L.plantarum）对 AFB1进行吸附研究，前者发现L.plantarum对AFB1的吸附强度为18.02%，后者发现L.plantarum CIDCA 83114能够去除 20%左右的AFB1。Hernandez-Mendoza 等（2009）将 L.casei L30 用于吸附 AFB1，发现L.casei L30对AFB1的吸附稳定性较好，并在随后的研究中证实磷壁酸在结合AFB1的机制中起到关键作用（Hernandez-Mendoza 等，2009）。 此外，Hamidi等（2013）测试了两种乳酸菌L.pentosus和L.beveris的磷壁酸分别以17.4%和34.7%的结合率吸附AFB1。虽然有多种微生物能够对AFB1产生吸附性能，但这些吸附作用大多数是不稳定的，存在可逆反应，不能将AFB1彻底的消除。因此，研究微生物对AFB1的降解作用至关重要。

1.2 微生物对黄曲霉毒素B1的降解作用 AFB1的生物法降解过程主要是通过微生物所产的胞外、胞内酶破坏AFB1的分子结构，将毒素分子降解成为无毒产物的过程。

1.2.1 真菌降解黄曲霉毒素B1运用真菌降解AFB1已有很多研究。Detroy和 Hesseltine（1969）发现AFB1环戊烷环上的酮羰基可被树状指孢霉（Dactylium dendroide）降解。Doyle 和 Marth（1979）报道寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）产生的乳过氧化物酶与黄曲霉毒素的降解呈正相关。Shantha（1999）利用茎点霉（Phoma sp.）培养基中的提取物降解AFB1，证实所提取的产物为一种胞外蛋白酶，具有热稳定性。很多关于糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）对 AFB1解毒的报道，如 Das等 （2014） 将P.ostreatus GHBBF10和P.ostreatus MTCC142与黄曲霉在稻草中共培养，这两种糙皮侧耳均能抑制黄曲霉的生长，并能有效地降解AFB1，最高降解率可达 89.41%；周露等（2014）发现优化后的P.ostreatus P1对AFB1的降解高达82.43%；Motomura等（2003）从 P.ostreatus分泌的产物中分离纯化出一种胞外酶，对这种酶的酶促反应的最佳环境条件进行了研究，通过对降解产物进行荧光检测，发现这种胞外酶能够减弱AFB1的荧光强度，推测酶的作用位点为AFB1的内酯环。 Wang 等（2011）对白腐菌（Trametes versicolor）进行研究，发现该菌分泌一种锰过氧化物酶（MnP）可以将 AFB1氧化为 AFB1-8，9-环氧化物，接着再被转化为 AFB1-8，9-二氢二醇来降低AFB1。 Liu 等（1998）发现假蜜环菌（Armillariella tabescens）对AFB1具有降解作用，对假蜜环菌胞内多酶复合体进行了提取，证明其可以作用于AFB1双呋喃环的烯醚键，生成AFB1的环氧化物，进一步水解为AFB1-8，9-二氢二醇。利用黑曲霉（Aspergillus niger）降解AFB1的报道也有很多。Zhang等（2014）研究了 A.niger ND-1 对 AFB1的去除效果，表明优化处理后的ND-1可以在24 h后除去58.2%的AFB1，并证实ND-1降解AFB1是利用其分泌的酶；陈仪本等（1998）获得了A.niger菌丝体的提取物（BDA），通过对温度、pH、时间以及水分进行研究BDA表明，BDA对AFB1的解毒过程是酶促的。通过真菌对AFB1的研究，发现其能够对AFB1起到不同程度的降解作用，但大多数真菌存在对AFB1解毒耗时长、操作过程繁琐和毒素降解不彻底的问题，限制了其在工业上的实际应用。

1.2.2 细菌对黄曲霉毒素B1降解作用 Cieglar等（1966）发现橙黄杆菌（Flavobaterium aurantiacum）能够不可逆的从溶液中去除黄曲霉毒素。Zhao 等（2011）提取黏细菌（Myxococcus fulvus）的上清液能够降解71.89%的AFB1，并分离出一种酶，命名为黏细菌黄曲霉毒素降解酶（MADE），并证明镁离子能够提升MADE的活性。Teniola等（2005）报道，分支杆菌（Mycobacterium fluoranthenivorans）利用其胞外分泌物与AFB1作用4 h后，降解率高达90%以上，作用8 h后毒素无残留；Hormisch等 （2004）筛选出一株能降解AFB1的M.fluoranthenivorans，并证实M.fluoranthenivorans是利用其合成的酶来分解AFB1。Alberts等（2006）检测了红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）对AFB1的降解能力，发现了R.erythropolis的上清液对AFB1的解毒效果远大于细胞内液或者细胞本身的解毒效果。Gao等（2011）发现枯草芽孢杆菌 ANSB060（Bacillus subtilis ANSB060）对于AFB1降解率达81.5%。Guan等（2008）筛选得到的嗜麦芽窄食单胞菌 （Stenotrophomonasmaltophilia）对AFB1最高降解率为84.8%，还表明S.maltophilia的上清液解毒能力最强，Zn2+和蛋白酶K的处理使解毒能力减弱，推测S.maltophilia对AFB1的降解具有酶促性。Samuel等（2014）研究了恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）对AFB1的解毒，P.putida在与AFB1作用24 h后完全解毒，通过气相色谱-质谱（GC-MS）和傅里叶变换红外光谱 （FTIR）分析降解产物发现，AFB1分别转化为AFD1、AFD2和 AFD3，降解产物的毒性远低于AFB1。王雪妍等（2017）发现了一株具有AFB1降解功能的食醚红球菌 （Rhodococcus aetherivorans），通过TLC及ELISA检测显示其对AFB1有降解活性，并推测其含有的FDR家族还原酶可能与降解活性有关。Adebo等 （2016）对假单胞菌VGF1（Pseudomonas anguilliseptica VGF1），荧光假单胞菌 （P.fluorescens）和葡萄球菌 VDF2（Staphylococcus sp.VGF2）的胞内液进行提取并用于AFB1解毒发现，当加入蛋白酶抑制剂时，这三种细菌的胞内液与AFB1作用6 h后的降解率分别达到66.5%、63%和100%。赵春霞等（2017）利用外淘汰法获得了一种复合菌系FBAD-2，这种复合菌系能够在短时间内降解高浓度的AFB1，在120 h内能够将2μg/mL的AFB1完全降解，并且该复合菌系能够在70℃范围内保持高活性，通过对复合菌系FBAD-2的基因组进行测序表明，其主要成分为梭菌（Clostridium）、土芽孢杆菌（Geobacillus）、嗜热小杆菌 （Symbiobacterium thermopilum）等构成。Wang等（2017）获得了一种新型嗜热复合菌系TADC7，TADC7 由 Geobacillus、Clostridium 等细菌构成，TADC7同样能够在高温下降解高浓度的AFB1，在120 h内将0.5μg/mL的AFB1彻底降解，并表示TADC7的上清液起主要解毒作用。这种耐高温，耐高浓度AFB1的微生物聚生体具有更广阔的应用前景。细菌及其产物能够将AFB1分解成毒性较低的产物甚至完全消除，大多研究仅表明细菌的上清液或胞内液中具有酶性质的成分，并没有彻底证实具体是哪一种成分起的作用，所以仍需进一步研究解毒酶的结构以及酶的解毒过程。

2 黄曲霉毒素B1的生物法脱毒应用

应用生物法降解食品与饲料中AFB1成为研究的热点。赵丽红等（2012）在被AFB1污染的鸡饲料中添加B.subtilis MLJ060菌，利用MLJ060菌在鸡的胃肠道内降解AFB1，缓解了AFB1对产蛋鸡生产能力和蛋品质的危害。程伟等（2014）研究了在饲料中添加益生菌和AFB1解毒酶对鸡生长的影响，结果明显降低了肉鸡的死亡率。胡常英等（2015）将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶复合，消除饲料中的AFB1，从而减轻AFB1对蛋鸡生长和生产的不良影响。Chen等（2015）发现嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳酸杆菌亚种（L.delbrueckii subsp） 能够将AFB1转化为AFB2a，将这两种益生菌与加热过的花生粕进行混合厌氧发酵，3 d后检测，当热处理与厌氧固体发酵相结合时，花生粕中黄曲霉毒素的生物转化率可达100%，MTT法结果证实发酵花生粕未见明显毒性。除此之外，热处理和厌氧固体发酵不会改变花生粕中的氨基酸浓度和分布。刘睿杰等（2012）研究了巨大芽孢杆菌（B.megaterium）发酵花生粕去除AFB1的最优条件，在最优发酵条件下，B.megaterium对AFB1的去除率达到68%，并且基本不会降低花生粕营养价值。张晓雪（2015）将诱变黑曲霉FS-UV1进行固定化并处理含AFB1的大鼠饲料，试验结果证明添加固定化的FS-UV1能够很好地解除AFB1对大鼠的肝脏和肾脏的损伤，避免毒素带来的各种不良影响。由此可见，益生菌和降解酶在AFB1生物法脱毒的应用中起到关键的作用，但尚存在一些问题，如酶的活性不高，酶缺乏稳定性，酶的解毒机制没有彻底阐明等，针对这些问题仍需深入研究。

3 总结

生物法脱除AFB1具有安全、环保、高效的特点，在防治AFB1污染的过程中起到关键的作用。但工业生产上还存在微生物解毒酶产量低、酶的活性不稳定，酶作用条件苛刻等问题。因此，为了更高效的解除AFB1带来的危害，需要筛选出能够高效产AFB1解毒酶的菌株，应用基因工程改造、定向进化等方法提升AFB1解毒菌的解毒能力。对解毒酶进行提取、分离、纯化，进而获得高活性成分，在清楚解毒机理的同时找到更安全的方法，使微生物解毒酶能够更高效的发挥作用，解决酶易失活等问题。在筛选解毒菌株的方法上，可以选择极端条件下，比如高温、高寒、高盐等，这样筛选出的菌种产生的解毒酶可能会更加稳定。研究AFB1降解的机理，能使微生物降解过程更具有可控性。还可以通过将AFB1降解酶基因在成熟模式生物中重组表达，以实现大规模工业生产，从而更好的降解AFB1。