骨髓间充质干细胞对肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响

2019-01-23朱凌峰陈书尚蔡锦全谭建明翁明芳

中华细胞与干细胞杂志(电子版) 2018年4期

朱凌峰陈书尚蔡锦全谭建明翁明芳

肾移植是终末期肾病最有效的治疗方法，但排斥反应仍是影响肾移植受者生存的重要因素之一。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种多能干细胞，具有多种生物学功能[1-2]。前期研究中发现自体MSCs免疫诱导可降低肾移植患者术后急性排斥反应和机会感染的风险、促进肾功能恢复[3]，证实了MSCs具有免疫调节能力，但其作用机制仍未完全阐明。本研究观察了MSCs肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响，探讨MSCs的体内免疫调节机制。

资料与方法

一、资料

MSCs组肾移植受者20例，供肾均来源于器官捐献，于2013年1月至2017年12月接受MSCs诱导+同种异体肾移植术，所有患者均签署知情同意书。平均年龄（40.1±9.4）岁，均为首次移植。对照组：于同期行异体肾移植的受者中，以1 : 1配对的方法，选择年龄、性别、原发病、尿毒症病程、供肾缺血时间、移植次数、配型和淋巴毒试验结果与实验组匹配的肾移植受者20例。两组患者术后免疫抑制方案均为霉酚酸酯+他克莫司+强的松。

二、方法

1. MSCs免疫诱导方案：分别于肾移植术中、术后 2周，将1 ～ 2×106个/kg自体 MSCs经外周静脉输注 MSCs悬液（细胞数为 1 ～ 2×106/kg·次）。MSCs的制备、保存和输注采用本中心之前报道的方法[3]。

2.外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/ CD4+细胞亚群比值和测定：两组患者分别于移植术前、术后第15天抽取静脉血2 ml，加入抗CD25- APC、抗CD4-FITC及抗FoxP3-PE，充分混后加入红细胞裂解液，避光孵育l5 ～ 25 min；PBS洗涤后，按照流式细胞仪检测程序，检测两组患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞亚群比值。

3.外周血细胞因子浓度检测：两组患者分别于移植术前、术后第15天抽取静脉血，分离血清，采用ELISA法检测白细胞介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）和白细胞介素 10（IL-10）浓度。操作严格按产品说明书进行。

4.免疫磁珠分选外周血T淋巴细胞：于移植术前、术后第15天抽取患者外周血，采用密度梯度离心法，将全血加到Percoll淋巴细胞分离液上方（比重为1.077 g/L），以1 000×g离心10 min，按说明书指示吸取分离介质之间的外周血单个核细胞，洗涤、离心后弃上清液。细胞冲洗混悬、计数，加入CD3 MagCellect免疫磁珠，4 ℃下孵育30 min。置于磁体中6 min，通过磁性分离柱获得外周血T淋巴细胞。

5. Rea1-time PCR法检测外周血T淋巴细胞中miRNA-155的表达：免疫磁珠分选的T淋巴细胞，加入裂解液裂解，Trizol法提取细胞总RNA模板。内参为小分子RNA U6，Rea1-time PCR采用两步法反应程序。以Opticon Monitor Software 3.1版软件分析数据，制作标准曲线，各组目的基因表达情况用ΔΔCt 值统计比较。

三、统计学分析方法

采用SPSS 12.0软件进行处理数据。外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞比值、IL-2、TNF-α和IL-10水平、T淋巴细胞miRNA-155表达量以± s表示，对照组与处理组间均数比较采用独立t检验，治疗前后均数比较采用配对t检验，以P＜ 0.05为差别有统计学意义。

表1 两组肾移植受者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞比值比较（%，± s）

分组例数移植前术后15 d t 值 P值对照组 10 10.88±2.11 26.06±4.77 9.629 P ＜ 0.001 MSCs组 10 11.60±2.82 30.44±4.23 10.154 P ＜ 0.001 t 值 0.534 2.365 P值 0.606 0.042

表2 MSCs对肾移植受者外周血炎性因子表达水平的影响（ng/L ，± s）

注：与术前比较，aP ＜0.01

分组例数IL-2 TNF-α IL-10术前术后15 d 术前术后15 d 术前术后15 d对照组 10 25.08±3.57 31.40±5.33a 56.57±5.46 46.67±6.71a 11.71±3.91 16.63±6.26a MSCs组 10 25.14±4.10 27.47±4.30 56.46±4.94 41.52±8.32a 11.83±4.08 20.35±5.10 t 值 0.049 2.252 0.064 2.157 0.095 2.062 P值 0.961 0.015 0.949 0.037 0.925 0.046

表3 MSCs对肾移植受者外周血T淋巴细胞miRNA-155表达的影响（± s）

分组例数术前术后15 d t 值 P值对照组 10 0.90±0.13 1.89±0.15 22.806 P ＜ 0.001 MSCs组 10 0.90±0.11 1.61±0.31 9.725 P ＜ 0.001 t 值 0.120 3.688 P值 0.905 0.001

结果

一、MSCs对外周血CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg细胞/CD4+细胞亚群比值的影响

流式细胞术检测结果显示，移植前两组肾移植受者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞比值差异无统计学意义；而术后第15天，MSCs组外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞亚群比值高于对照组（P＜ 0.01，表 1）。

二、MSCs对外周血IL-2、TNF-α和IL-10浓度的影响

EILISA检测结果显示，移植前两组受者外周血IL-2、TNF-α和IL-10水平差异无统计学意义。移植后15天，与术前相比，对照组外周血IL-2（t=4.401，P＜ 0.001）和 IL-10（t= 5.118，P＜ 0.001）水平均上升，而 TNF-α 则下降（t= 2.979，P= 0.005）；与对照组相比，MSCs组外周血IL-2和TNF-α水平均下降，而IL-10则上升（表2）。

三、MSCs对肾移植术后外周血T淋巴细胞miRNA-155表达的影响

Rea1-time PCR检测结果显示，移植前两组肾移植受者外周血T淋巴细胞的miRNA-155表达水平差异无统计学意义（P＞ 0.05）。移植后15天，两组患者外周血T淋巴细胞的miRNA-155表达水平均高于移植前；与对照组相比，MSCs组的miRNA-155表达水平降低（表3）。

讨论

诱导移植免疫耐受是目前器官移植领域的研究热点之一。骨髓MSCs是目前研究范围最为广泛的成体干细胞之一，不仅具有多向分化潜能，还具有免疫调节等多种功能[1-5]。前瞻性临床研究发现，异体肾移植联合自体MSCs输注，能促进肾功能恢复，且术后急性排斥反应和机会感染的风险降低，证实了MSCs能诱导肾移植术后免疫耐受[3]，但具体的体内作用机制尚不明确。

T淋巴细胞在肾移植术后排斥反应中发挥着重要作用，参与了移植物抗原识别、分泌细胞因子调节免疫、溶细胞效应等免疫应答[6]。监测肾移植受者外周血T淋巴细胞的数量和功能状态，有助于了解移植患者的免疫状态[7-8]。本研究之前采用ImmuKnow法检测外周血CD4+T细胞ATP含量，动态观察MSCs和舒莱诱导的肾移植受者术后外周血CD4+T细胞的免疫功能，发现MSCs诱导能有效抑制患者细胞免疫功能[9]。体外研究发现，MSCs能够抑制CD4+T淋巴细胞增殖，抑制T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等Th1类细胞因子，促进IL-10等Th2类细胞因子的产生[5,10]。吴卫真等[11]在亲属供肾肾移植移植术前，经门静脉注射供者的骨髓细胞，与一般肾移植受者相比，移植肾排斥发生率和免疫抑制剂用量降低，且患者外周血IL-10升高，TNF-a表达升高，表现出免疫低反应性。本研究也有类似发现，MSCs组移植术后15天的外周血IL-2和TNF-α水平较对照组均下降，而IL-10则上升。此外，体外研究发现，MSCs可诱导混合淋巴细胞培养体系中Treg细胞的分化并促进其增殖[12]。本研究中，移植术后第15 天，MSCs组外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞亚群比值高于对照组，说明MSCs在体内也对Treg细胞有促进作用。

miRNA-155位于人类21号染色体，在T细胞、B细胞、树突状细胞等多种活化的免疫细胞中均高表达，在免疫细胞的激活中起着重要作用，而其表达受到多种细胞因子的调节[13]。此外，miRNA-155对CD4+T细胞的亚群分化和免疫功能具有重要的调节功能，可通过IFN-γ-STAT1通路促进T细胞向Th1细胞分化和树突状细胞产生IL-2[14]。miRNA-155对Treg的细胞数量和功能状态均具有调节作用：可促进CD4+T细胞分化为Treg细胞、维持Treg数量的作用、降低效应性T细胞对Treg抑制作用的敏感性[15-16]。

MSCs和miRNA-155均可通过作用于T淋巴细胞的亚群分化而发挥免疫调节功能，但MSCs是否通过miRNA-155发挥免疫调节作用仍不明确。我们先前的体外研究发现，MSCs能够降低被激活的T淋巴细胞miRNA-155的表达水平[17]。本研究结果进一步表明，MSCs在体内也具有下调T淋巴细胞miRNA-155表达的作用。这些结果提示：MSCs作用于T淋巴细胞后，影响相应细胞因子和miRNA-155的表达，进而影响T淋巴细胞亚群分化和免疫功能，诱导肾移植后免疫耐受。

综上所述，本研究结果表明，MSCs可升高肾移植受者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞亚群比值、影响相关细胞因子表达水平、降低T淋巴细胞miRNA-155表达，这些作用与MSCs诱导肾移植术后免疫耐受有关。