复方苦参注射液影响HL-60细胞迁移的机制研究

盛贤福 王 珺 庄海峰 张 宇 陈均法

复方苦参注射液（compound kushen injection，CKI）是从苦参和白土苓两味中药中经提取精制而成的一种中药注射剂，主要有效成分包括氧化苦参碱、苦参碱、槐定碱、黄酮类等，其功效主要为清热利湿、凉血解毒、散结止痛等，一直广泛应用于多种实体肿瘤的辅助治疗[1]。研究发现，CKI除了明显减轻放化疗的副反应、改善生存质量、减轻癌症疼痛等功效外，有增强放化疗疗效、调节免疫微环境等作用[2]。澳洲阿德莱德大学的David Adelson研究团队发现，CKI能够改变细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡相关靶基因表达，从而表现出惊人的杀灭肿瘤细胞的疗效[3]。关于CKI在血液肿瘤中应用的报道较少，张暖等[4]报道CKI能增强CAG预激方案[CAG方案，包括阿克拉霉素（aclarubicin）、小剂量阿糖胞苷（cytarabine）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）]在老年急性白血病患者中的化疗疗效，但其具体机制仍无人涉及。本研究以HL-60细胞为急性髓细胞白血病模型，体外研究CKI能否影响HL-60细胞的迁移能力，并探讨其中可能存在的表观遗传学机制。

1 材料与方法

1.1 材 料 IMDM培养基（杭州吉诺生物有限公司，GNM-1200），胎牛血清（FBS，美国 Gibco，批号10100-147），复方苦参注射液（Compound Kushen Injection，批号 Z14021231，5mL/支，山西振东制药股份有限公司），人重组粒细胞集落刺激因子（rhGCSF，批号 201302B06，150μg/支，厦门特宝生物工程股份有限公司），SDF-1α（美国Sigma-Aldrich公司，批号 SRP3253），Trizol（日本 Takara公司，批号A7205-1），反转录酶（美国Thermo公司，批号EP0441），PCR 试剂盒（qPCR SYBR Green Mix，东盛公司，批号 P2092），兔抗人CXCR4单抗（美国Santa公司，1:1500，批号 sc-9046），鼠抗人 β-Tubulin单抗（天津三箭生物技术有限公司，1:1500，批号 KM9003），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（美国 Santa公司，1:1500，批号 sc-2004），8μ 孔径的Trasnwell小室（美国Costar，批号 3422）。

1.2 细胞培养 HL-60细胞株由中国科学院上海细胞研究所馈赠。HL-60用含20%FBS的IMDM培养液，在37℃、5%CO2、95%相对湿度的培养箱中培养。选取对数生长期细胞用于实验。

1.3 实验分组 蛋白质印迹和PCR时实验分以下五组：实验CKI组（0.5ng/mL）、阳性对照 G-CSF组（40ng/mL）、CKI和G-CSF联合加药组、空白对照组（IMDM培养液），处理48h后收集细胞，离心，弃上清，用于蛋白印迹和PCR实验。细胞迁移实验时分以下五组：空白对照组（无SDF-1α）、SDF-1α（100ng/mL） 组、SDF-1α+CKI组、SDF-1α+G-CSF 组和SDF-1α+CKI联合G-CSF组。

1.4 蛋白质印迹法 取120μL加样缓冲液（内含蛋白裂解液，蛋白酶抑制剂）于冰上裂解HL-60细胞，12 000r/min、4℃离心1min。取蛋白上清液，BCA法检测蛋白浓度，溶于加样缓冲液中100℃煮沸10min，用30%SDS-PAGE电泳。采用湿转法转至硝酸纤维素（PVDF）膜，用封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST溶液）室温封闭膜30min。然后放置在相应的CXCR4和β-Tubulin一抗中4℃孵育过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育1h。ECL（美国PerkinElmer公司）化学发光检测，自动成像仪（上海天能科技有限公司）成像，凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司）分析结果。

1.5 实时荧光定量PCR 收集各组细胞（约5×105细胞），Trizol法提取总RNA，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。取质量相等的RNA经反转录试剂盒逆转成cDNA，用于后续PCR。各基因PCR引物及反应条件见表1。用实时荧光定量PCR法检测CXCR4、miRNA-146a及内参hATCB在HL-60细胞中的表达量，采用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。

1.6 Transwell小室迁移实验 为减少非特异性迁移及增加HL-60细胞对SDF-1α敏感性，实验前用无FBS的IMDM饥饿培养液（以0.5%BSA代替）饥饿48h。迁移实验前用饥饿培养液平衡Transwell小室2h。HL-60细胞经处理（CKI、G-CSF或联合处理48h）或不做任何处理后，PBS漂洗1次，再用饥饿培养液重悬细胞，调整浓度为5×106/mL。上室加入100μL各组细胞悬液，下室加入600μL含100ng/mL SDF-1α的饥饿培养液（无SDF-1α组只含饥饿培养液），培养条件下孵育3h。收集下室液体，离心，弃上清，0.5mL饥饿培养液重悬。流式细胞仪计数，在高速通道条件下吸取20s，计数下室细胞数。迁移指数=（有SDF-1α时迁移至下室细胞数/无SDF-1α时迁移至下室细胞数）。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 统计学方法 本研究数据采用SPSS19.0统计软件进行处理。每个实验均独立重复3次，呈正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，各组数据两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组对HL-60细胞迁移指数的影响 G-CSF降低细胞CXCR4表达后会动员HSC和中性粒细胞至外周血循环，在体外实验中表现为G-CSF处理后细胞向SDF-1α迁移能力下降。HL-60细胞经饥饿48h 后，分别予以 0.5ng/mL CKI、40ng/mL G-CSF 或联合处理48h，然后用Transwell小室检测细胞迁移能力变化。结果如表2所示，SDF-1α明显促进HL-60细胞的迁移，而CKI、G-CSF单药或联合用药均能明显阻断HL-60细胞的迁移，且联合加药组阻断更明显。这表明，CKI能像G-CSF一样明显抑制HL-60细胞的迁移能力，并且两者具有协同作用。

表2 各组对HL-60细胞迁移指数的影响（

表2 各组对HL-60细胞迁移指数的影响（

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与 SDF-1α 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与 SDF-1α+CKI联合 CKI组比较，▲▲P＜0.01；CKI：复方苦参注射液；G-CSF：粒细胞集落刺激因子；SDF-1α：基质细胞衍生因子-1α

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2.2 各组对CXCR4、miR-146a基因表达影响 CKI组、G-CSF组能明显降低HL-60细胞CXCR4 mRNA表达，联合加药组降低更明显；CKI组、G-CSF组可以显著上调miR-146a mRNA表达（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组对CXCR4 mRNA、miR-146a表达影响

表3 各组对CXCR4 mRNA、miR-146a表达影响

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 G-CSF 联合 CKI组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；CKI：复方苦参注射液；G-CSF：粒细胞集落刺激因子；CXCR4：趋化因子 CXC 受体 4；mRNA：信使 RNA；miR-146a：微小RNA-146a

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2.3 各组CXCR4蛋白表达的影响 CKI组、G-CSF组、CKI联合G-CSF组均能够不同程度抑制CXCR4蛋白表达，尤以联合加药组为甚。见图1。

图1 各组对CXCR4蛋白表达的影响

3 讨论

1995年日本学者报道在老年急性髓细胞白血病（AML）患者中应用预激方案获得较高的治疗疗效、较低的化疗相关心脏毒性和较好的化疗耐受性[5]。然而对于CAG方案的具体作用机制目前仍不甚明确，许多研究主要聚焦于以下两大机制：（1）G-CSF预激有助于促使处于静止期（G0期）休眠状态的白血病及其前体细胞进入细胞周期，增强阿糖胞苷和阿克拉霉素对它们的细胞毒杀伤作用；（2）通过消弱基质细胞对白血病干细胞的保护作用发挥效应[6]。基质细胞对白血病的保护作用依赖于骨髓微环境与白血病细胞之间的直接接触，而这首先需要白血病细胞迁移、归巢至骨髓微环境。在此过程中，表达于白血病细胞表面的CXCR4与基质细胞分泌的CXCL12（趋化因子CXC配体12，又称为基质细胞衍生因子-1α，SDF-1α）之间的相互作用占据着举足轻重地位[7]。

化疗耐药已成为白血病治疗的一大难题，也是目前血液肿瘤研究的前沿热点之一。研究表明，骨髓微环境为白血病细胞提供了“庇护”，使得白血病细胞免于化疗药物诱导的杀伤[6]。据报道，骨髓微环境在微观上可看作无数特化的微龛（niche），通过与白血病细胞，尤其是白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs）之间的相互作用，促进白血病的发生、发展及耐药[8]。因此，阻断微环境与白血病之间的相互作用，增强化疗药物杀伤作用正成为解决化疗耐药的一大方向。在骨髓微环境-白血病细胞之间的相互作用中，最受人瞩目的是CXCR4/CXCL12信号轴[9]。我们的前期研究发现，CXCR4是介导AML耐药的关键靶点，CXCR4介导了白血病细胞向骨髓微环境的迁移、粘附，最终躲避于骨髓微环境而导致化疗耐药，而利用G-CSF能够明显下调CXCR4蛋白的表达，从而阻断上述过程。进一步的表观遗传学方面的研究发现，CXCR4表达受到miR-146a的调控，CXCR4可能是miR-146a的靶基因之一，而miR-146a在AML中明显下调。同时，G-CSF能够上调miR-146a表达。

杨勤等[10]研究发现，CKI也能够下调胃癌细胞的CXCR4蛋白表达而抑制肿瘤细胞的增殖。因此，我们大胆设想，CKI也能够作用于miR-146a靶向调控CXCR4这一靶点，而表现出不俗的增强化疗疗效、部分逆转耐药的效果。本研究表明，CKI、G-CSF预处理HL-60细胞后，其向趋化因子SDF-1α迁移的能力明显下降，这表明CKI确实能够影响HL-60细胞的迁移、趋化能力。而进一步的机制研究发现CKI能够明显上调miR-146a表达，同时显著下调CXCR4 mRNA、CXCR4蛋白的表达，并且与G-CSF具有协同效应。因此，CKI能通过上调miR-146a表达而下调CXCR4蛋白表达，从而抑制白血病细胞趋化、迁移能力。目前已经知道，白血病细胞趋化、迁移至骨髓微环境是其受庇护于微环境并对传统化疗药物耐药的先决条件，这说明CKI可能是通过抑制CXCR4表达而抑制白血病细胞的迁移能力，最终打破微环境—白血病细胞之间的相互作用，而增强化疗疗效。当然，这需要进一步的实验来证实。

综上所述，CKI能够通过上调miR-146a表达而靶向下调CXCR4蛋白表达，从而影响HL-60细胞的趋化、迁移能力，并与预激方案中的重要药物GCSF具有协同作用。CKI可能正是通过调节miR-146a/CXCR4这一信号途径打破骨髓微环境对白血病细胞的保护作用，从而部分逆转耐药，最终表现为增强CAG等预激方案的化疗疗效。