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高效液相色谱测定乳制品、谷物粉及饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物

2019-01-23武伦玮刘春霞刘丽君

乳业科学与技术 2019年1期
关键词:乙酰化定容衍生物

武伦玮,岳 虹,陈 静,刘春霞,刘丽君

(内蒙古伊利实业集团股份有限公司,内蒙古 呼和浩特 010110)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又称呕吐毒素,是一种来源于镰刀菌属的单端孢霉烯族化合物。3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol,3-ADON)和15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyl-deoxynivalenol,15-ADON)为DON的乙酰化衍生物。食用被DON污染的食物后,会产生恶心、呕吐、腹泻等急性中毒症状。经实验研究证实,DON及其衍生物可以和其他真菌毒素产生联合作用,加剧动物肝、肾脏细胞膜损伤和氧化损伤,导致动物过早死亡[1-2]。目前,同时检测DON及其乙酰化衍生物的方法大多是使用液相色谱-串联质谱法[3],该方法对硬件设备和人员的要求较高,推广起来相比液相色谱法相对较难[4-6]。本研究建立一种适合乳制品和普通饲料基质的可同时测定DON及其乙酰化衍生物的高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)定量分析方法,以供检验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈(色谱纯) 诺尔施(成都科隆化学品有限公司);氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾(均为分析纯) 天津风船化学试剂公司;盐酸(分析纯) 北京试剂公司;DON、3-ADON、15-ADON标准品(纯度≥99.0%) 美国Sigma-Aldrich公司。

饲料采集自伊利牧场;谷粒多牛乳、益消风味酸乳及薏米粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

1.2 仪器与设备

脱氧雪腐镰刀菌烯醇3 项(DON/3-ADON/15-ADON)免疫亲和柱(产品编号:HCM30508,柱容量≥1 000 ng) 北京华安麦科生物技术有限公司;Agilent 1260高效液相色谱仪(配备紫外检测器)美国Agilent公司;AB265-S分析天平 瑞士Mettler-Doledo公司;3k30高速离心机 德国Sigma公司;GM 200高速粉碎机(转速10 000 r/min) 德国Retsch公司;筛网(孔径1~2 mm) 安平县鸿凯金属丝网制品厂;TurboVapLV氮吹仪 瑞典Biotage公司;KQ-600DB超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;VORTEX 2涡旋振荡器 德国IKA公司;HY-5摇床江苏省金坛市医疗仪器厂;移液器(量程10~100 μL和100~1 000 μL) 德国Eppendorf公司;玻璃纤维滤纸(直径11 cm,孔径1.5 μm) 美国Vicam公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

液相色谱柱:艾杰尔Venusil MP C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)或相当者[7-8];紫外检测波长224 nm;流速1.0 mL/min;柱温35 ℃;进样量50 µL;流动相梯度洗脱程序如表1所示。

表 1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient mobile phase composition

1.3.2 溶液配制

磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS):称取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、0.20 g KH2PO4和1.16 g Na2HPO4·12H2O,加入800 mL超纯水溶解并定容至1 L;体积分数80%乙腈水溶液:将800 mL乙腈和200 mL水混合;体积分数0.1%吐温-20水溶液:取1 mL 吐温-20,加水定容至1 L。

标准储备溶液(100 μg/mL):分别称取DON、3-ADON和15-ADON各1 mg(准确至0.01 mg),分别用乙腈溶解并定容至10 mL,-20 ℃条件下密封保存。

混合标准中间液(10 μg/mL):分别准确吸取100 μg/mL DON、3-ADON和15-ADON标准储备溶液各1.0 mL于同一10 mL容量瓶中,加乙腈定容,-20 ℃条件下密封保存。

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系列标准工作溶液:准确吸取适量标准储备溶液,用流动相(乙腈∶水=12∶88,V/V)稀释,配制成质量浓度分别为100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列标准工作液,4 ℃条件下保存。

1.3.3 样品处理

1.3.3.1 配合饲料、浓缩料、精补料等吸水性较小的样本

将样品粉碎,准确称取4 g样品,加入20 mL PBS缓冲溶液;用摇床剧烈振荡20 min,充分提取,5 000 r/min离心5 min,调节pH值至中性,用微纤维滤纸过滤;取5 mL滤液过免疫亲和柱净化,滤液以1~2 滴/s的速率流出;待液体流出后用20 mL水淋洗免疫亲和柱,流速2~3 滴/s,并充分排干;取2 mL甲醇洗脱,用玻璃试管接洗脱液,流速1 滴/s;洗脱后液体于50 ℃条件下经氮吹仪吹干,残余物于4 ℃条件下存放,使用时用1 mL 20%乙腈溶液复溶;过0.45 μm有机滤膜后上机[9-11]。

1.3.3.2 乳制品

准确称取2.5 g样品于10 mL容量瓶,使用PBS缓冲液定容,摇床振荡20 min,充分提取,5 000 r/min离心5 min,用微纤维滤纸过滤[12-13];取2 mL滤液过免疫亲和柱净化,滤液以1~2 滴/s的速率流出,待液体流出后用10 mL 0.1%吐温水溶液淋洗免疫亲和柱,流速2~3 滴/s,再用10 mL水淋洗,并充分排干;取2 mL甲醇洗脱,用玻璃试管接洗脱液,流速1 滴/s,洗脱后液体于50 ℃条件下用氮吹仪吹干,残余物于4 ℃存放,使用时用1 mL 20%乙腈溶液复溶,过0.45 μm有机滤膜后上机。

1.3.3.3 谷物粉、米粉

准确称取4 g样品(固体样品需粉碎过筛),以1∶4(m/V)的比例加入80%乙腈水溶液(即16 mL)[14-16],混匀,超声提取1 5 m i n;取4 m L液体,以1∶7(m/V)的比例加入PBS缓冲液(即28 mL)稀释,混匀,使用玻璃纤维滤纸过滤;取16 mL滤液过免疫亲和柱净化,滤液以1~2 滴/s的速率流出;待液体流出后,用10 mL 0.1%吐温水溶液淋洗免疫亲和柱,流速2~3 滴/s,再用10 mL水淋洗,并充分排干;取2 mL甲醇洗脱,用玻璃试管接洗脱液,流速1 滴/s;洗脱后液体于50 ℃条件下用氮吹仪吹干,残余物于4 ℃存放,使用时用1 mL 20%乙腈溶液复溶;过0.45 μm有机滤膜后上机。

试样中DON、15-ADON或3-ADON的含量按照下式计算。

式中:X为试样中DON、3-ADON或15-ADON的含量/(μg/kg);ρ1为试样中DON、3-ADON或15-ADON的质量浓度/(ng/mL);ρ0为空白试样中DON、3-ADON或15-ADON的质量浓度/(ng/mL);V为样品洗脱液的最终定容体积/mL;f为样液稀释因子;m为试样质量/g。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择

DON易溶于极性溶剂,如水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯,吸水性较小的样本可以直接用水提取,既有较高的提取效率、又经济无毒。而选择PBS缓冲盐体系,则是为了保证溶液体系呈中性,以保证免疫亲和柱不失活。对于吸水性较大的样品则需要添加沉淀剂,加入80%乙腈水溶液,然后将乙腈提取液稀释到一定比例,是为了防止乙腈破坏免疫亲和柱,使免疫亲和柱失活。DON及其乙酰化衍生物测定的基础是抗原和抗体反应,抗体连接在柱体内,样品经过提取、过滤后缓慢通过免疫亲和柱,在免疫亲和柱内毒素与抗体结合,之后洗涤免疫亲和柱,除去没有被结合的其他无关物质[14-16]。用甲醇洗脱,然后注入液相色谱仪进行检测。

2.2 色谱柱和流动相的选择

采用艾杰尔Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,对于其他C18色谱柱,经过实验验证,色谱峰有可能会出现15-ADON、3-ADON被杂质峰覆盖等情况。流动相选择乙腈和水,在目标峰周围无杂峰干扰,定量准确。如果使用甲醇和水进行洗脱,效果不太理想,或在上述条件下无法分离目标化合物。

2.3 标准曲线及检出限

将不同质量浓度的DON、15-ADON或3-ADON工作液在上述洗脱条件下经液相色谱仪测定。以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

表 2 DON、3-ADON及15-ADON的标准曲线及定量限Table 2 Standard curves and limits of quantitation for DON, 3-ADON and 15-ADON

由表2可知,标准曲线的线性关系良好,按照信噪比(RS/N)=10,计算得出该方法的定量限为100 μg/kg。

将DON、15-ADON及3-ADON的混合标准样品按照上述色谱条件进样,所得色谱图如图1所示。饲料样品中加入DON、15-ADON及3-ADON的混合标准品后所得色谱图如图2所示。

2.4 方法回收率和精密度

分别向饲料、谷物乳、发酵乳和谷物粉中添加不同质量浓度的DON、15-ADON和3-ADON,进行加标回收率实验,分别平行测定6 次。

表 3 不同样品的加标回收率测定结果(n= 6)Table 3 Recoveries of spiked samples (n= 6)

由表3可知,本底样品中DON、15-ADON和3-ADON的添加量为100~500 μg/kg时,饲料、谷物乳、发酵乳和谷物粉中的回收率分别为84.4%~99.9%、94.3%~101.6%、96.0%~103.7%和88.8%~100.0%。

表 4 不同样品的精密度测定结果Table 4 Precision (RSD) for replication determinations of different samples

对饲料、谷物乳、发酵乳和谷物粉检出限附近的加标样品分别进行6 次重复测定。由表4可知,本方法的准确度满足定量要求,方法精密度良好。

3 结 论

本研究采用HPLC法对乳品和饲料中的DON及其乙酰化衍生物进行含量测定,本方法适用于饲料、液态乳、酸乳、米粉及谷物粉中DON及其乙酰化衍生物的含量检测。样品中加入PBS缓冲溶液作为提取剂,采用免疫亲和柱净化,氮吹仪浓缩后用流动相复溶,C18色谱柱分离,流动相为乙腈和水,进行梯度洗脱,目标峰不受杂质峰干扰,测定结果准确。

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