高效液相色谱测定乳制品、谷物粉及饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物

武伦玮，岳 虹，陈 静，刘春霞，刘丽君

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素，是一种来源于镰刀菌属的单端孢霉烯族化合物。3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON）和15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-acetyl-deoxynivalenol，15-ADON）为DON的乙酰化衍生物。食用被DON污染的食物后，会产生恶心、呕吐、腹泻等急性中毒症状。经实验研究证实，DON及其衍生物可以和其他真菌毒素产生联合作用，加剧动物肝、肾脏细胞膜损伤和氧化损伤，导致动物过早死亡[1-2]。目前，同时检测DON及其乙酰化衍生物的方法大多是使用液相色谱-串联质谱法[3]，该方法对硬件设备和人员的要求较高，推广起来相比液相色谱法相对较难[4-6]。本研究建立一种适合乳制品和普通饲料基质的可同时测定DON及其乙酰化衍生物的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析方法，以供检验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（色谱纯） 诺尔施（成都科隆化学品有限公司）；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾（均为分析纯） 天津风船化学试剂公司；盐酸（分析纯） 北京试剂公司；DON、3-ADON、15-ADON标准品（纯度≥99.0%） 美国Sigma-Aldrich公司。

饲料采集自伊利牧场；谷粒多牛乳、益消风味酸乳及薏米粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

1.2 仪器与设备

脱氧雪腐镰刀菌烯醇3 项（DON/3-ADON/15-ADON）免疫亲和柱（产品编号：HCM30508，柱容量≥1 000 ng） 北京华安麦科生物技术有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪（配备紫外检测器）美国Agilent公司；AB265-S分析天平 瑞士Mettler-Doledo公司；3k30高速离心机 德国Sigma公司；GM 200高速粉碎机（转速10 000 r/min） 德国Retsch公司；筛网（孔径1～2 mm） 安平县鸿凯金属丝网制品厂；TurboVapLV氮吹仪 瑞典Biotage公司；KQ-600DB超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；VORTEX 2涡旋振荡器 德国IKA公司；HY-5摇床江苏省金坛市医疗仪器厂；移液器（量程10～100 μL和100～1 000 μL） 德国Eppendorf公司；玻璃纤维滤纸（直径11 cm，孔径1.5 μm） 美国Vicam公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

液相色谱柱：艾杰尔Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或相当者[7-8]；紫外检测波长224 nm；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量50 µL；流动相梯度洗脱程序如表1所示。

表 1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient mobile phase composition

1.3.2 溶液配制

磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）：称取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、0.20 g KH2PO4和1.16 g Na2HPO4·12H2O，加入800 mL超纯水溶解并定容至1 L；体积分数80%乙腈水溶液：将800 mL乙腈和200 mL水混合；体积分数0.1%吐温-20水溶液：取1 mL 吐温-20，加水定容至1 L。

标准储备溶液（100 μg/mL）：分别称取DON、3-ADON和15-ADON各1 mg（准确至0.01 mg），分别用乙腈溶解并定容至10 mL，-20 ℃条件下密封保存。

混合标准中间液（10 μg/mL）：分别准确吸取100 μg/mL DON、3-ADON和15-ADON标准储备溶液各1.0 mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈定容，-20 ℃条件下密封保存。

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系列标准工作溶液：准确吸取适量标准储备溶液，用流动相（乙腈∶水=12∶88，V/V）稀释，配制成质量浓度分别为100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列标准工作液，4 ℃条件下保存。

1.3.3 样品处理

1.3.3.1 配合饲料、浓缩料、精补料等吸水性较小的样本

将样品粉碎，准确称取4 g样品，加入20 mL PBS缓冲溶液；用摇床剧烈振荡20 min，充分提取，5 000 r/min离心5 min，调节pH值至中性，用微纤维滤纸过滤；取5 mL滤液过免疫亲和柱净化，滤液以1～2 滴/s的速率流出；待液体流出后用20 mL水淋洗免疫亲和柱，流速2～3 滴/s，并充分排干；取2 mL甲醇洗脱，用玻璃试管接洗脱液，流速1 滴/s；洗脱后液体于50 ℃条件下经氮吹仪吹干，残余物于4 ℃条件下存放，使用时用1 mL 20%乙腈溶液复溶；过0.45 μm有机滤膜后上机[9-11]。

1.3.3.2 乳制品

准确称取2.5 g样品于10 mL容量瓶，使用PBS缓冲液定容，摇床振荡20 min，充分提取，5 000 r/min离心5 min，用微纤维滤纸过滤[12-13]；取2 mL滤液过免疫亲和柱净化，滤液以1～2 滴/s的速率流出，待液体流出后用10 mL 0.1%吐温水溶液淋洗免疫亲和柱，流速2～3 滴/s，再用10 mL水淋洗，并充分排干；取2 mL甲醇洗脱，用玻璃试管接洗脱液，流速1 滴/s，洗脱后液体于50 ℃条件下用氮吹仪吹干，残余物于4 ℃存放，使用时用1 mL 20%乙腈溶液复溶，过0.45 μm有机滤膜后上机。

1.3.3.3 谷物粉、米粉

准确称取4 g样品（固体样品需粉碎过筛），以1∶4（m/V）的比例加入80%乙腈水溶液（即16 mL）[14-16]，混匀，超声提取1 5 m i n；取4 m L液体，以1∶7（m/V）的比例加入PBS缓冲液（即28 mL）稀释，混匀，使用玻璃纤维滤纸过滤；取16 mL滤液过免疫亲和柱净化，滤液以1～2 滴/s的速率流出；待液体流出后，用10 mL 0.1%吐温水溶液淋洗免疫亲和柱，流速2～3 滴/s，再用10 mL水淋洗，并充分排干；取2 mL甲醇洗脱，用玻璃试管接洗脱液，流速1 滴/s；洗脱后液体于50 ℃条件下用氮吹仪吹干，残余物于4 ℃存放，使用时用1 mL 20%乙腈溶液复溶；过0.45 μm有机滤膜后上机。

试样中DON、15-ADON或3-ADON的含量按照下式计算。

式中：X为试样中DON、3-ADON或15-ADON的含量/（μg/kg）；ρ1为试样中DON、3-ADON或15-ADON的质量浓度/（ng/mL）；ρ0为空白试样中DON、3-ADON或15-ADON的质量浓度/（ng/mL）；V为样品洗脱液的最终定容体积/mL；f为样液稀释因子；m为试样质量/g。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择

DON易溶于极性溶剂，如水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯，吸水性较小的样本可以直接用水提取，既有较高的提取效率、又经济无毒。而选择PBS缓冲盐体系，则是为了保证溶液体系呈中性，以保证免疫亲和柱不失活。对于吸水性较大的样品则需要添加沉淀剂，加入80%乙腈水溶液，然后将乙腈提取液稀释到一定比例，是为了防止乙腈破坏免疫亲和柱，使免疫亲和柱失活。DON及其乙酰化衍生物测定的基础是抗原和抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后缓慢通过免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱，除去没有被结合的其他无关物质[14-16]。用甲醇洗脱，然后注入液相色谱仪进行检测。

2.2 色谱柱和流动相的选择

采用艾杰尔Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，对于其他C18色谱柱，经过实验验证，色谱峰有可能会出现15-ADON、3-ADON被杂质峰覆盖等情况。流动相选择乙腈和水，在目标峰周围无杂峰干扰，定量准确。如果使用甲醇和水进行洗脱，效果不太理想，或在上述条件下无法分离目标化合物。

2.3 标准曲线及检出限

将不同质量浓度的DON、15-ADON或3-ADON工作液在上述洗脱条件下经液相色谱仪测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

表 2 DON、3-ADON及15-ADON的标准曲线及定量限Table 2 Standard curves and limits of quantitation for DON, 3-ADON and 15-ADON

由表2可知，标准曲线的线性关系良好，按照信噪比（RS/N）=10，计算得出该方法的定量限为100 μg/kg。

将DON、15-ADON及3-ADON的混合标准样品按照上述色谱条件进样，所得色谱图如图1所示。饲料样品中加入DON、15-ADON及3-ADON的混合标准品后所得色谱图如图2所示。

2.4 方法回收率和精密度

分别向饲料、谷物乳、发酵乳和谷物粉中添加不同质量浓度的DON、15-ADON和3-ADON，进行加标回收率实验，分别平行测定6 次。

表 3 不同样品的加标回收率测定结果（n= 6）Table 3 Recoveries of spiked samples (n= 6)

由表3可知，本底样品中DON、15-ADON和3-ADON的添加量为100～500 μg/kg时，饲料、谷物乳、发酵乳和谷物粉中的回收率分别为84.4%～99.9%、94.3%～101.6%、96.0%～103.7%和88.8%～100.0%。

表 4 不同样品的精密度测定结果Table 4 Precision (RSD) for replication determinations of different samples

对饲料、谷物乳、发酵乳和谷物粉检出限附近的加标样品分别进行6 次重复测定。由表4可知，本方法的准确度满足定量要求，方法精密度良好。

3 结 论

本研究采用HPLC法对乳品和饲料中的DON及其乙酰化衍生物进行含量测定，本方法适用于饲料、液态乳、酸乳、米粉及谷物粉中DON及其乙酰化衍生物的含量检测。样品中加入PBS缓冲溶液作为提取剂，采用免疫亲和柱净化，氮吹仪浓缩后用流动相复溶，C18色谱柱分离，流动相为乙腈和水，进行梯度洗脱，目标峰不受杂质峰干扰，测定结果准确。