超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱快速筛查与确证生鲜牛乳中80种抗生素和激素

2019-01-22贡松松吴剑平

分析测试学报 2019年1期

贡松松,张婧，严凤，吴剑平,潘娟，顾欣

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

近年来，不断出现的食品安全问题日益受到人们的关注。牛奶作为一种老少皆宜的营养食品，其安全问题尤为突出，而抗生素和激素残留已成为牛奶安全问题中较严重的一种。欧盟对兽药残留限量均作了严格规定[1]。我国为加强兽药残留监控和保障动物性食品安全卫生，也对兽药最高残留限量作了严格规定[2]。

抗生素是微生物在代谢过程中产生的一种对其他微生物具有杀灭或抑制作用的次级代谢产物，其广泛应用于畜牧业生产和兽医临床诊断以及呼吸系统、消化系统和生殖系统感染的治疗[3]。随着抗生素的大面积使用，加之养殖户趋利心理和法律意识淡薄，不遵守休药期、擅自加大用量等，导致抗生素残留日益严重[4]。激素是由体内特定器官产生，通过血液运输到其他器官并以极其微小的量来产生调节生物体代谢、平衡作用的生理化学物质的总称[5]。激素作为促生长剂使用时可提高动物的生长率，然而其对人、动物和环境具有很多潜在危害，更有致癌风险。欧盟96/22/EC指令、美国食品药物管理局(FDA)规定禁止在食品源性动物中使用激素类药物，我国农业部第235公告也对此作了详细规定[2,6]。面临严峻的食品安全形势，开发出高效、准确、灵敏的检测方法显得尤为迫切。

兽药多残留的前处理技术主要有液-液萃取[7-9]、固相萃取[10]、基质固相分散技术[11-12]以及QuEChERS[13-14]等。其中QuEChERS原本应用于农残领域[15]，因其快速、简便、安全、有效等特点，在兽药残留领域也得到了广泛应用[16-17]。兽药多残留的检测方法主要有GC[18]、GC-MS[19]、HPLC[20]、LC-MS/MS[21-23]，以及应用日益增多的高分辨质谱(如Orbitrap、TOF等)[24-25]。GC和LC方法由于本身检测器的局限，定性能力不足，多兽残筛查领域应用有限。而LC-MS法因具有灵敏度高、准确性好、分析速度快等优势而在兽药残留分析中得到广泛应用，已有的国家标准多数是针对某一类兽药进行检测[26-28]。目前国内对于单类抗生素或激素的检测方法已日渐成熟，但同时检测抗生素和激素因存在种类多、性质差异大等挑战而研究相对较少。本文参考相关国家标准和文献[2,13-14,29]，比较了超滤膜和QuEChERS在多残留前处理方面的优劣势，并最终采用改良的QuEChERS方法，结合以四极杆-飞行时间质谱为代表的高分辨质谱技术，建立了生鲜牛乳中80种抗生素和激素的筛查和检测方法。该方法不仅缩短了检测时间，而且提高了定性结果的准确度，从而实现了对生鲜牛乳中多种类抗生素和激素的快速筛查与定性确证。

1 实验部分

1.1 试剂、药品与材料

乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；乙酸(分析纯，上海凌峰化学试剂公司)；无水硫酸钠、氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷(ODS C18)(美国Agilent公司)；超滤离心管(3 kD，美国Millipore公司)；实验用水为超纯水(Milli-Q自制)。

抗生素、激素标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司和美国Sigma公司；所有标准物质纯度：90.0%～99.9%；80种抗生素和激素标准品的相关信息见表1。

表1 80种抗生素和激素的保留时间、理论分子量、实测分子量、质量误差以及质谱碎片离子Table 1 Retention times，theoretical masses，experimental masses，mass errors and MS fragmentat ions of 80 antibiotics and hormones

(续表1)

No. CompoundRetentiontime(min)Theoretical mass(m/z)Experimentalmass(m/z)Mass error(ppm)Fragment ions(m/z)8Methyltestosterone(甲基睾酮)9.651303.231 9303.231 6-1.07285.220 4,267.209 4,189.163 5,109.064 59Stanozolol(司坦唑醇)9.609329.258 7329.258 1-1.97287.199 6,269.188 4,135.116 9,121.064 310Mesterolone(美睾酮)10.024305.247 5305.247 3-4.44285.221 0,173.131 8,109.064 7,97.064 711Progesterone(孕酮)11.135315.231 9315.231 91.12297.220 1,255.209 9,123.080 1,109.064 512Medroxyprogesterone acetate(甲羟孕酮乙酸酯)10.945387.253 0387.251 0-4.64327.229 9,285.219 7,267.209 4,123.079 913Norethindrone(炔诺酮)8.995299.200 6299.200 40.96281.189 2,231.172 8,119.085 5,109.064 61417α-Hydroxyprogesterone acetate(17α-醋酸羟基孕酮)10.472373.237 3373.237 1-0.61313.216 4,281.247 5,227.128 0,158.153 815Megestrol acetate(醋酸甲地孕酮)10.845385.237 3385.237 00.61325.215 4,267.173 5,224.154 8,105.069 516Melengestrol acetate(醋酸美仑孕酮)11.003397.237 3397.237 30.64315.231 7,279.159 6,205.086 5,149.023 317Norgestrel(炔诺孕酮)10.853325.216 2325.216 40.56322.270 2,279.158 8,194.120 4,140.071 318D(minus)-norgestrel(左炔诺孕酮)9.891313.216 2313.216 20.60309.173 0,236.106 0,209.164 6,99.008 519Chlormadinone acetate(醋酸氯地孕酮)10.654405.182 7405.182 3-1.23385.235 8,301.133 9,267.173 4,105.069 620Triamcinolone(曲安西龙)6.034395.186 4395.186 4-0.13375.179 5,194.115 7,172.133 1,144.138 121Cortisone(可的松)6.723361.201 0361.201 41.55343.189 8,163.111 1,121.063 7,107.085 422Prednisolone(泼尼松龙)6.642361.201 0361.201 41.55343.190 8,171.149 1,144.138 2,118.086 123Betamethasone(倍他米松)7.194393.207 2393.206 7-1.17373.201 1,171.148 6,144.138 2,121.050 924Dexamethasone(地塞米松)7.212393.207 2393.206 7-1.17373.199 3,355.189 8,237.126 1,147.079 225Hydrocortisone(氢化可的松)6.681363.216 6363.215 91.2343.190 1,171.080 5,147.080 1,121.064 226F1umethasone(氟米松)7.121411.197 8411.197 5-0.49343.189 6,282.278 8,171.148 4,144.138 027Methylprednisolone(甲基泼尼松龙)7.071375.216 6375.215 4-2.24357.204 4,339.194 1,161.095 4,135.080 028Amoxicillin(阿莫西林)4.607366.111 8366.111 90.01349.084 9,208.042 9,134.059 2,114.000 329Ampicillin(氨苄西林)5.142350.116 9350.117 00.28333.088 7,192.047 3,160.042 1,106.065 130Cefradine(头孢拉定)5.163350.116 9350.117 00.28176.070 2,158.026 3,140.016 0,108.080 231Penicillin Ⅴ(青霉素Ⅴ)7.175351.100 9351.100 71.06192.065 2,160.042 2,126.037 2,114.036 832Oxacillin(苯唑西林)7.486402.111 8402.111 6-0.64338.219 4,280.176 9,237.159 9,187.111 333Cloxacillin(氯唑西林)7.834436.072 8436.072 8-1.19277.036 4,178.004 9,160.041 7,114.036 934Nafcillin(奈夫西林)8.025415.132 2415.131 5-1.51371.181 6,253.123 6,121.063 9,107.084 535Cephalexin(头孢氨苄)5.317348.101 3348.100 9-0.86174.054 4,158.026 9,140.016 1,106.065 136Penicillin G(青霉素G)5.467335.106 0335.105 8-0.29189.069 2,176.070 2,160.042 1,114.036 837Cefazolin(头孢唑啉)5.649455.037 3455.036 9-0.82350.117 0,335.105 8,172.133 1,158.027 038Cefoperazone(头孢哌酮)5.865646.149 7646.149 1-0.89455.036 2,194.116 4,176.072 2,158.026 739Azithromycin(阿奇霉素)5.611749.515 8749.515 3-0.8591.421 2,422.266 1,375.265 8,172.133 140Tylosin(泰乐菌素)6.756916.526 4916.525 4-1.04772.446 7,318.188 8,174.111 6,101.059 341Tilmicosin(替米考星)5.943869.573 3869.573 40.92749.516 8,435.293 0,422.267 0,375.265 642Spiramycin(螺旋霉素)5.545843.521 3843.520 5-0.94591.421 3,422.266 0,375.265 7,296.214 843Tiamulin(泰妙菌素)7.452494.329 9494.329 0-1.58435.290 5,363.725 0,192.105 5,144.138 244Roxithromycin(罗红霉素)7.701837.531 8837.532 50.22679.437 8,494.335 5,419.270 4,279.159 045Josamycin(交沙霉素)8.207828.474 0828.472 2-2.28573.373 7,494.333 8,419.270 8,366.237 546Sulfamethazine(磺胺二甲嘧啶)5.802279.091 0279.090 8-0.28213.112 6,186.032 5,156.010 6,108.044 147Sulfadiazine(磺胺嘧啶)5.271251.059 7251.059 6-0.55214.091 5,184.086 3,156.010 9,108.044 148Sulfadimethoxine(磺胺二甲氧嘧啶)6.656311.080 9311.081 41.84293.101 2,255.124 3,209.116 5,108.044 149Sulfathiazloe(磺胺噻唑)5.312256.020 9256.020 8-0.65214.092 8,156.010 6,108.044 7,101.016 750Sulfapyridine(磺胺吡啶)5.445250.064 5250.064 2-4.12199.097 5,156.010 7,108.044 1,101.016 251Sulfachloropyridazine(磺胺氯哒嗪)6.092285.020 8285.021 31.17217.105 2,156.087 4,130.014 3,108.044 252Sufamerazine(磺胺甲嘧啶)5.586265.075 4265.074 90.31234.134 1,186.034 2,156.010 8,108.044 553Sulfacetamide(磺胺醋酰)5.055215.048 5215.048 60.46156.011 2,108.044 6,92.049 6,65.038 754Sulfatroxazole(磺胺曲沙唑)5.594268.075 0268.074 8-0.85173.018 8,157.013 2,108.044 2,92.049 455Sulfaphenazole(磺胺苯吡唑)6.747315.091 0315.091 10.71222.032 2,160.085 8,140.015 6,92.049 956Sulfabenzamide(磺胺苯甲酰)6.615277.064 1277.064 20.01156.010 9,108.044 4,80.049 9,65.038 857Sulfamethizole(磺胺甲噻二唑)5.702271.031 8271.031 6-0.5156.011 9,108.044 4,92.049 7,65.039 258Sulfamethoxypyridazine(磺胺甲氧哒嗪)5.744281.070 3281.073 24.65186.031 1,156.011 2,124.086 3,92.049 659Sulfamethoxazole(磺胺甲唑)6.241254.059 4254.059 20.02188.081 8,147.078 9,92.049 6,65.039 060Marbofloxacin(马波沙星)5.246363.146 3363.148 74.58341.149 7,286.098 3,203.061 2,84.080 561Fleroxacin(氟罗沙星)5.321370.137 3370.137 1-1.02352.146 9,342.160 4,321.137 0,152.067 062Enoxacin(依诺沙星)5.213321.135 7321.136 14.14224.127 7,180.589 8,161.072 3,152.067 1

(续表1)

No. CompoundRetentiontime(min)Theoretical mass(m/z)Experimentalmass(m/z)Mass error(ppm)Fragment ions(m/z)63Ofloxacin(氧氟沙星)5.288362.151 1362.158 51.06340.144 4,318.160 9,261.103 0,203.060 964Pefloxacin(培氟沙星)5.304334.156 1334.155 4-2.51314.129 1,288.160 9,265.114 3,231.055 865Norfloxacin(诺氟沙星)7.511320.140 5320.140 40302.128 8,288.150 0,231.055 9,205.076 666Ciprofloxacin(环丙沙星)5.321332.140 5332.140 4-0.36314.129 2,265.113 7,231.055 8,205.076 067Danofloxacin(达氟沙星)5.371358.156 1358.155 5-2.11342.160 2,316.181 6,255.055 5,203.060 768Lomefloxacin(洛美沙星)5.404352.146 7352.147 00.33340.144 7,318.161 1,261.102 7,245.107 969Enrofloxacin(恩诺沙星)5.470360.171 8360.170 1-4.84340.145 2,288.149 8,261.103 2,203.061 770Sarafloxacin(沙拉沙星)5.686386.131 1386.130 8-0.53368.120 5,342.139 7,299.097 3,285.082 571Cinoxacin(西诺沙星)6.233263.066 2263.066 2-0.3245.055 7,217.060 7,189.028 6,161.033 472Nalidixic acid(萘啶酸)7.386233.092 1233.091 7-0.33215.081 6,187.050 0,159.054 8,131.060 073Flumequine(氟甲喹)7.469262.087 4262.087 3-0.27244.075 9,234.134 3,202.029 1,174.034 274Nadifloxacin(那氟沙星)6.971361.155 8361.155 9-1.05320.140 2,262.088 1,233.092 5,187.050 375Tetracycline(四环素)5.495445.160 5445.159 8-1.61427.148 3,410.121 9,241.084 6,154.048 976Doxycycline(强力霉素)5.988445.160 5445.159 8-1.61428.133 8,321.074 1,267.063 9,201.054 877Chlortetracycline(金霉素)5.876479.121 6479.121 3-0.97462.093 5,444.083 7,275.046 4,154.049 978Oxytetracycline(土霉素)5.337461.155 5461.154 9-1.23443.143 6,426.117 3,201.053 9,154.049 679Lincomycin(林可霉素)5.064407.221 0407.219 4-4.32359.217 3,279.095 2,172.133 6,126.126 980Clindamycin(克林霉素)5.802425.187 1425.186 5-1.81422.263 5,350.222 2,174.111 6,101.059 5

1.2 仪器与设备

6530超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(美国Agilent公司)，包括G4220A流动相输送泵、G4226A自动进样器、G1316C柱温箱及G4212A二极管阵列检测器；MassHunter数据处理系统(美国Agilent公司)；AE240电子天平(瑞士Mettler公司)；Allegra X-22R高速冷冻离心机(德国Beckman公司)；多管漩涡振荡器(北京Targin公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.3 标准溶液的配制

称取10 mg标准品(根据纯度折算质量)，用色谱纯甲醇溶解并定容至10 mL，制成1 g/L的单标贮备液。对于每类化合物，将单标贮备液混合制成50或100 mg/L的混合标准溶液，使用时再根据需要混合或稀释。配制好的标准品贮备液置于4 ℃环境下低温避光保存。

1.4 样品前处理

准确称取5.0 g牛乳样品于50 mL离心管中，加入0.1 g Na2EDTA和20 mL 1%乙酸乙腈溶液，涡旋振荡1 min，加入4.0 g无水硫酸钠和1.0 g氯化钠，涡旋振荡4 min，8 000 r/min离心5 min。准确移取10 mL上层清液于离心管中，加入1.0 g无水硫酸钠和0.2 g C18，涡旋振荡器振荡 4 min，8 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液于40 ℃氮气吹至近干，用1.0 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(5∶95，体积比)定容，涡旋30s，过0.22 μm滤膜后，供超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定。

1.5 仪器条件

1.5.1超高效液相色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相A为0.1% 甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～2 min，5% B，2～4 min，5%～40% B；4～9 min，40%～80% B；9～9.5 min，80%～95% B；9.5～15 min，95%B；15～17 min，95%～5%B；17～20 min，5%B；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

1.5.2质谱条件离子源：Dual AJS ESI，正离子模式；扫描范围：50～1 000m/z；干燥气温度：320 ℃；干燥气流速：8 L/min；雾化气压力：35 psig(1 psig=6 895 Pa)；鞘气温度：400 ℃；鞘气流速：12 L/min；毛细管电压：4 000 V；喷嘴电压：500 V；碎裂电压：130 V；飞行时间管真空度：2.04×10-7Torr；仪器在高分辨率(4 GHz)，低质量范围(

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1色谱柱的选择比较了ZORBAX SB C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)、Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)和Extend C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)3种色谱柱对80种抗生素和激素药物的分离度和检测灵敏度。实验表明，ZORBAX SB C18色谱柱更适合于分析目标药物，虽然50 mm色谱柱用时更短，但不能保证每种药物都有良好的峰形。在粒径相同的情况下，采用100 mm色谱柱，结合高分辨质谱的优异性能，能获得良好的分离度。80种抗生素和激素药物的提取离子色谱图见图1。

图1 80种抗生素和激素药物的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatogram of 80 antibiotics and hormones

2.1.2流动相的选择以乙腈为有机系流动相，考察了不同pH值的水系流动相(水、0.1%甲酸水溶液、1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、1%乙酸水溶液)对目标药物在色谱柱上分离效果的影响。结果表明，流动相酸度较高或不添加酸性溶液时，峰形较差。而在流动相中添加0.1%甲酸时，可提高目标药物的离子化效率，且分离效果令人满意。故选择乙腈和0.1%甲酸水溶液作为流动相，采用梯度洗脱方式可以很好地将80种抗生素和激素药物分离，且具有较好的灵敏度和分辨率。

图2 80种抗生素和激素药物的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of 80 antibiotics and hormones

2.1.3梯度洗脱条件的优化由于80种抗生素和激素的极性差异较大，采用恒定的流动相很难将各药物分开，故采用梯度洗脱方式，通过改变流动相的极性，从而达到目标药物完全分离的目的。实验比较了初始流动相中不同比例的有机相(5%、10%、20%)和不同的洗脱时间(12、15、20 min)对洗脱效果的影响。结果显示，随着乙腈比例的升高，多数药物被快速洗脱，未达到良好的分离，当乙腈的初始比例为5%时，目标药物的洗脱速度缓慢，且分离良好。随着洗脱时间的增加，全部药物均能有较好的灵敏度和分辨率。故选择初始流动相有机相比例为5%，洗脱时间为20 min。图2为80种抗生素和激素药物的总离子流色谱图。

2.1.4定容液的选择样品定容液不仅会影响目标药物的分离效果，还会影响离子化效率。本实验比较了0.1% 甲酸水溶液，以及不同体积比(5∶95、20∶80、50∶50、90∶10)的乙腈-0.1%甲酸水溶液作为定容液时的分离情况。实验发现，当定容液有机相比例超过初始流动相中的有机相比例时，多数药物的峰形变宽。当有机相比例不大于初始流动相时，峰形较尖锐，本实验选择体积比为5∶95的乙腈-0.1%甲酸水溶液作为定容液，此时有机相比例与初始流动相比例相同。

2.2 质谱条件的优化

Dual AJS ESI正离子模式下，在50～1 000m/z范围内作一级质谱全扫描，得到80种抗生素和激素药物的总离子色谱图。比较各化合物的提取离子色谱图的响应强度和峰形，依次优化鞘气温度和流速、喷嘴电压、毛细管电压、雾化气压力、干燥气温度和流速。然后优化不同的碎裂电压，在定性分析软件中，选择最优电压参数，详细参数见“1.5.2”。

2.3 样品前处理方法的选择

2.3.1超滤膜方法的优化称取5.0 g牛乳样品于50 mL离心管中，加入0.1 g Na2EDTA和20 mL 1%乙酸乙腈溶液，涡旋振荡30 s，8 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液于40 ℃氮气吹至近干，用1.0 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(5∶95)定容后，转移至3 kD的超滤离心管中，15 000 r/min离心60 min，净化后的提取液用于进样分析。实验比较了未经初始流动相润洗超滤膜(A组)和经初始流动相润洗超滤膜(B组)对超滤离心管净化效果的影响。80种抗生素和激素的回收率数据采用SPSS软件进行统计分析。数据表明，A、B两组的平均回收率均较低，分别为48.8%和54.8%，回收率整体不理想。这可能与超滤膜对药物产生了吸附作用有关。

2.3.2QuEChERS提取步骤的优化为了同时提取绝大多数的目标药物，实验比较了不同酸度的乙腈作为提取液：乙腈(A)、0.1%甲酸乙腈(B)、1%甲酸乙腈(C)、0.1%乙酸乙腈(D)、1%乙酸乙腈(E)。80种抗生素和激素的回收率数据经SPSS软件统计分析。结果显示，A、E两组的平均回收率较高，分别为81.9%和83.1%。但A组的标准偏差为35%，E组为25%。E组的标准偏差更小，各化合物的回收率更接近，故选择E组(1%乙酸乙腈)作为最佳提取溶剂。

实验发现，使用1%乙酸乙腈作为提取剂时，超过90%的药物回收率为50%～120%，但3种四环素类药物的回收率低于50%。推测四环素类药物回收率低的原因可能与其易与牛奶中的钙、镁离子螯合形成难溶盐有关[30]。为提高其回收率，在不影响其余目标药物的条件下，使用Na2EDTA作为螯合剂。结果显示，5 g乳中加入0.1 g Na2EDTA，以20 mL 1%乙酸乙腈作为提取剂时，多西环素、土霉素、四环素及金霉素的回收率得到提高，分别为76%、65%、85%和101%。

2.3.3QuEChERS净化步骤的优化传统的QuEChERS方法使用无水硫酸镁作为吸水剂，但为了减少牛乳中的镁离子，使Na2EDTA作为螯合剂能更好地发挥作用，实验选用无水硫酸钠作为吸水剂。脂肪和蛋白质干扰的消除对牛乳样品的检测至关重要。PSA和C18均可用于去除脂肪酸、色素和糖类等基质成分。但文献表明这些分散固相萃取剂在净化样品的同时有可能对目标物产生一定的吸附作用，因此有必要对PSA(A组)和C18(B组)进行优化。80种抗生素和激素的回收率数据经SPSS软件统计分析，结果表明，B组的平均回收率较大，为90.0%，表明回收率趋势更高。A组的四环素类药物平均回收率低于50%，可能与PSA对其的吸附有关。此外，A组的标准偏差为38%，B组为19%，B组的标准偏差更小，各化合物的回收率更接近，故选择B组(C18)作为最佳吸附剂。

实验结果表明，超滤膜虽然能够节省时间，简化步骤，但方法的整体回收率偏低。QuEChERS方法更适用于药物多残留的分析。

2.4 方法学验证

2.4.1基质效应、标准曲线与线性范围基质效应是指基质中的共提取干扰物影响目标化合物的离子化，这也是液相色谱-串联质谱法的弊端之一，因此有必要对基质效应进行考察。本实验在空白生鲜牛乳基质提取液中添加不同浓度的80种抗生素和激素药物混标溶液，并与相应初始流动相中的信号强度(即峰面积)进行比较，以Matrix Effect (ME) 表示基质效应，结果如表2所示。从表中可以观察到，61%的化合物基质效应不明显，介于80%～120%之间。而睾酮、甲基睾酮、环丙沙星、四环素类药物以及部分喹诺酮类药物出现明显的基质增强效应，其余药物均出现不同程度的基质抑制效应。因此本实验采用基质匹配标准曲线外标法定量。取空白生鲜牛乳样品基质，根据目标抗生素和激素在质谱中响应的强弱，加入不同浓度的混合标准工作液，按“1.4”样品前处理方法进行提取，测定提取液中的目标化合物。以待测物的分子离子峰面积对其质量浓度(μg·L-1)作标准曲线，各药物在各自浓度范围内线性关系良好(r2≥0.990 0)，80种抗生素和激素的线性方程、线性范围及相关系数见表2。

2.4.2检出限与定量下限用空白牛乳基质提取液稀释标准曲线的最低浓度，以3倍仪器检测信噪比(S/N=3)计算各化合物的定性筛查检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)计算定量下限(LOQ)。结果表明，80种抗生素和激素的LOD为2～50 μg/kg，LOQ为5～100 μg/kg。

2.4.3回收率与精密度在优化条件下，采用空白生鲜牛乳样品进行加标回收率及相对标准偏差实验，样品分别添加低(1LOQ)、中(2LOQ)、高(5LOQ)3个浓度的标准溶液，每个浓度平行测定6次，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)。80种抗生素和激素药物的回收率为 50.2% ～ 119%，相对标准偏差为0.3% ～19.0%。

表2 80种抗生素和激素的线性范围、相关系数、检出限及定量下限Table 2 Linear ranges，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ)of 80 antibiotics and hormones

(续表2)

No.CompoundME/%Linear rangeρ/(μg·L-1)r2LODw/(μg·kg-1)LOQw/(μg·kg-1)58Sulfamethoxypyridazine75.610～2000.996 351059Sulfamethoxazole86.410～2000.999 251060Marbofloxacin12310～5000.990 051061Fleroxacin11810～5000.991 751062Enoxacin95.410～5000.995 351063Ofloxacin96.320～5000.991 6102064Pefloxacin84.210～5000.997 151065Norfloxacin85.350～5000.990 6205066Ciprofloxacin14210～5000.992 551067Danofloxacin12510～5000.999 951068Lomefloxacin86.210～2000.996 851069Enrofloxacin95.310～2000.999 451070Sarafloxacin87.420～2000.999 0102071Cinoxacin11210～5000.999 951072Nalidixic acid84.310～1000.999 451073Flumequine95.210～2000.995 751074Nadifloxacin11210～2000.996 751075Tetracycline13210～1 0000.996 351076Doxycycline12410～1 0000.998 451077Chlortetracycline12810～1 0000.999 951078Oxytetracycline12910～1 0000.995 851079Lincomycin87.55～5000.998 32580Clindamycin82.45～1 0000.994 425

2.5 实际样品的测定

应用本方法对全国8个省市的80份生鲜牛乳样品进行检测，结果发现：头孢氨苄检出阳性1批，含量为19.1 μg·kg-1；替米考星检出阳性2批，含量分别为6.8 μg·kg-1和6 μg·kg-1；泰乐菌素检出阳性3批，含量分别为14.7 μg·kg-1、15.0 μg·kg-1和14.8 μg·kg-1；磺胺吡啶检出阳性4批，含量分别为1.7 μg·kg-1、2.7 μg·kg-1、7.8 μg·kg-1和1.4 μg·kg-1；环丙沙星检出阳性1批，含量为18.5 μg·kg-1，均低于农业部规定的最高残留限量。从检测数据分析，孕酮的含量为20.8～32.5 μg·kg-1，平均值为26.1 μg·kg-1。由于孕酮为天然激素，推测可能为奶牛体内的内源性激素。