响应面法优化黑种草皂苷A双水相提取工艺研究

阿米热·艾则孜， 李晨阳， 胡 旭， 徐 芳， 赵 军

(1新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011； 2新疆药物研究所维吾尔药重点实验室， 乌鲁木齐 830004)

黑种草子为毛茛科(Ranunculaceae)黑种草属1年生草本植物瘤果黑种草(Nigellaglandulifera.)的干燥成熟种子，又名腺毛黑种草，在我国新疆大部分地区都有种植，药材资源丰富[1]。研究表明，黑种草子的主要化学成分为皂苷、黄酮和生物碱类化合物等，其中黑种草皂苷A(NigegllanosideA)是该药材中含量最高的水溶性成分[2-3]，具有抗氧化、抗肿瘤、镇痛镇静、健脑补肾、活血通经等药理作用，临床上常用于健忘耳鸣、乳少经闭等病症的治疗[4-5]。本课题组前期考察了黑种草总皂苷的最佳提取工艺[6]，但对黑种草皂苷A(NigegllanosideA)的提取工艺研究未见报道。本研究以单因素实验为基础，结合响应面分析法对黑种草皂苷A的提取工艺进行优化，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器AL-204型电子天平(上海市梅特勒托利多-仪器有限公司)，Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，AS10200ADT型超声玻璃清洗器(天津市奥特赛恩斯仪器有限公司)，OSB-2011型旋转蒸发仪(上海市爱朗仪器有限公司)，HF-105A型高速多功能粉碎机(永康市辰禾盛丰工贸有限公司)。

1.2试药黑种草皂苷A对照品(新疆维吾尔自治区药物研究所植化室制备，纯度>98%)，乙腈(美国Fisher公司,批号:A959-4，色谱纯)，无水乙醇(山东佰仟化工有限公司，批号:10009218，分析纯)，硫酸铵 (广东翁江化学试剂有限公司，批号:PA01080 ，分析纯)。

1.3药材黑种草子药材2017年11月购于安徽亳州药材市场，经新疆药物研究所何江副研究员鉴定为瘤果黑种草(Nigellaglandulifera.)的干燥成熟种子。

2 方法

2.1黑种草皂苷A的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相:乙腈-水(28∶72)，柱温30℃，波长210 nm，流速1.0 mL/min。

2.1.2 标准曲线绘制 称取黑种草皂苷A对照品10.06 mg，加甲醇稀释成浓度为1.006 mg/mL的溶液。分别量取黑种草皂苷A对照品溶液各0.1、0.5、1.0、2.0、4.0置于5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。分别吸取黑种草皂苷A系列对照品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，以对照品溶液浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到回归方程：Y=1 471.4X-2.428 6(R2=0.999 9)，黑种草苷A在0.021～1.006 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液的制备 取黑种草子粉碎,过40目筛，称取粉末1.0 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入乙醇-硫酸铵双水相适量，静置1 h，超声提取30 min，滤过，滤液置分液漏斗中静置分层，取上层乙醇相清液，蒸干，甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶中，定容，即得。

[式中:Y为样品浓度(mg/mL)；X为定容体积(mL)；m为称取样品的质量(mg)]

2.2单因素试验以黑种草皂苷A的提取率为指标，固定其他条件，依次改变料液比(m∶v，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、硫酸铵用量(m/v，0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g/mL)、乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%)和超声时间(10、20、30、40、50 min)进行测定。

2.3Box-Behnken响应面试验选择料液比、硫酸铵用量和乙醇浓度为主要影响因素，黑种草皂苷A提取率为指标，设计了3因素3水平的响应面分析实验，见表1。

表1 响应面的影响因素水平表

3 结果

3.1单因素考察

3.1.1 料液比对黑种草皂苷A提取率的影响 当料液比为1∶40，提取率最高，因此确定料液比为1∶40，见图1。

3.1.2 硫酸铵用量对提取率的影响 当硫酸铵浓度达到0.35 g/mL时，提取率达到最大，因此确定硫酸铵用量为0.35 g/mL，见图2。

3.1.3 乙醇浓度对提取率的影响 当乙醇浓度为50%时，提取率增加的趋于平稳，结合乙醇浓度对提取率的影响，因此确定乙醇浓度为50%，见图3。

3.1.4 超声时间对提取率的影响 当超声时间为30 min时提取率最高，超声时间越长，双水相的稳定性越差，从而影响黑种草皂苷A的提取效果，因此确定超声时间为30 min，见图4。

3.2响应面实验设计与数据结果

3.2.1 响应面实验设计 在单因素的基础上，选择料液比、硫酸铵用量和乙醇浓度进行 3因素 3 水平共计17个实验点的响应面分析实验，见表2。

3.2.2 响应面实验数据 以黑种草皂苷A的提取率为响应值，采用Design-Expert软件对试验中的数据进行二次多元回归拟合，建立二次响应面回归模型如下：Y=3.01-0.021A-0.094B-0.18C-0.12AB+0.20AC-0.23BC-0.47A2-0.17B2-0.34C2(R2=0.945 7)。表明该实验模型拟合度良好，能够描述所选因素与响应值的关系。对模型进行方差分析，由F值大小可以判断，各因素对黑种草皂苷A提取率的影响大小顺序为：C>B>A，即乙醇浓度>硫酸铵用量>料液比，见表3。

3.2.3 响应面实验设计结果 由各因素交互作用影响的响应面图及其等高线图关系显示，位于椭圆区域中心的点为黑种草皂苷A提取率最高点，由中心向周围边缘呈逐渐降低趋势，处于同一椭圆型曲线上的黑种草皂苷A提取率相同。交互项AC和BC交互明显，而AB项交互作用不显著。根据模型优化的最佳提取条件为料液比1∶39.30，硫酸铵用量0.35 g/mL，乙醇浓度47.35%。考虑到实际操作条件，对模型优化的工艺条件进行修正：料液比1∶ 39，硫酸铵用量0.35 g/mL，乙醇浓度47%。按照此条件进行验证实验，3次平行实验所得黑种草皂苷A的提取率实测平均值为3.15%，RSD为1.91%。模型预测值为3.04%，实测值与预测值的相对误差为2.59%，基本一致。最佳提取工艺条件为为：料液比1∶39，硫酸铵用量0.35 g/mL，乙醇浓度47%，见图5～7。

表2 响应面实验设计表

表3 响应面二次模型的方差分析表

注：*P<0.05为差异不显著,**P<0.01为差异显著。

3.3验证实验称取100 g黑种草子，按照修正的优化工艺条件进行验证实验，结果3次平行实验所得黑种草皂苷A提取率的平均值为3.15%，RSD为1.9%。模型预测值为3.04%，实测值与预测值的相对误差为2.59%，说明理论的最佳提取工艺有效可行。

4 讨论

皂苷类化合物易溶于水、乙醇、甲醇等的溶剂 ，难溶于乙醚、石油醚等亲脂性溶剂[7]，常用的提取方法有水煎煮[8]、渗漉法[9]、回流法[10]、浸渍法[11]等。双水相萃取法是指在一定的条件下，具有亲水性的聚合物与水混合后形成两相溶液，利用被分离化合物在两相中分配的差异而达到分离[12]，该技术具有萃取条件温和、分相快速、成本低、操作简单、无溶剂残留、操作可连续化等优点，已被广泛应用于天然活性成分的规模化生产中[13]。已有研究报道采用响应面法对双水相提取工艺进行优化[14,15]。本研究采用响应面法优化双水相提取黑种草皂苷A的工艺，方法操作简单、稳定可行，适用于黑种草皂苷A的提取。