重组BCG-EgG1Y162蛋白免疫小鼠对细粒棘球蚴感染中Tim-3因子表达的影响

李玉娇， 沙 桐， 张峰波， 赵 慧， 杨 妍， 刘 斌， 王红英， 丁剑冰,3

(新疆医科大学1第一附属医院， 乌鲁木齐 830054, 2基础医学院; 3省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室， 乌鲁木齐 830011)

包虫病是一种在农牧区传播的寄生虫病，不仅在全世界蔓延，新疆也是其重灾区[1]。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin Vaccine,BCG)[2]是我国用于预防儿童结核病比较成熟的疫苗。其具有载体与佐剂的特点，是通过分子生物学基因工程技术将外源目的基因导入BCG中，表达外源抗原，诱导对多种疾病的特异性体液和细胞免疫应答[3]，目前已成为疫苗研究的新途径[4]。EgG1Y162抗原是本课题组曹春宝等[5]发现的一类针对终末宿主的具有较强免疫原性的一个包虫病候选基因抗原。在前期的研究中，祖力皮也·吐尔逊等[6]通过电穿孔的方法成功构建了BCG-EgG1Y162疫苗。马秀敏等[7]在后续的实验中也检测了该疫苗免疫小鼠对其IgG抗体水平的影响，以及相关因子水平的改变。赵慧等[8]在对正常人和感染细粒棘球蚴的慢性感染病人血清检测中发现感染病人血清中的可溶性Tim3细胞因子及其配体Galectin-9高表达，进一步导致了Th1/Th2免疫细胞的失衡，从而导致了包虫感染的持续性进程。本研究通过对比免疫BCG-EgG1Y162疫苗后的小鼠和未经过免疫的小鼠在包虫感染后血清内可溶性Tim3和Galectin-9水平及IFN-γ、IL-12和IL-4的水平的检测，旨在观察该疫苗是否能够纠正Th1/Th2细胞的失衡，从而进一步干预包虫病的慢性进行性感染的情况。

1 材料与方法

1.1实验动物及包虫包囊6～8周龄雌性SPF级的BALB/C小鼠，质量18～22 g，购自于新疆医科大学第一附属医院动物实验中心。活细粒棘球蚴由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供的感染包虫的沙鼠而获得。

1.2BCG-EgG1Y162疫苗BCG-EgG1Y162疫苗由新疆医科大学免疫学教研室保存并提供。

1.3仪器设备全自动酶标仪购自美国Bio-rad公司，SYBR Green PCR premix购自于美国Invitrogen公司，PCR扩增仪购自美国Bio-rad公司，Trizol购自于美国Invitrogen公司，Revert Aid TM.First strand cDNA synthesis Kit购自于加拿大Fermentas公司，离心机购自于德国Effendorf公司。

1.4方法

1.4.1 实验动物模型的建立 将实验小鼠30只随机平均分为2组，分别是实验组和正常对照组，实验组进行1次BCG-EgG1Y162疫苗的注射，在小鼠腹部皮下无菌注射用剂量为100 μL用PBS调整浓度为1×106cfu的BCG-EgG1Y162疫苗。对照组小鼠也在相同时间用PBS100 μL进行等量的注射。10周后，取沙鼠体内包囊中的活细粒棘球蚴液进行小鼠腹部的无菌注射，100 μL约计数为1 000只活原头蚴。

1.4.2 血清收集 小鼠在BCG-EgG1Y162疫苗免疫24周后采用摘眼球取血和颈椎脱臼法处死小鼠，获得大量血液，一部分的血清于-20℃条件下冻存，一部分血液用来提取实时荧光定量PCR所需的RNA。

1.4.3 实时荧光定量PCR 用Trizol试剂盒从小鼠血液中提取RNA，具体按照说明书的步骤将其反转录其为cDNA，扩增体系为20：cDNA2 μL，2×mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，其余用ddH2O补足体系。反应条件为50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃15 s，60℃30 s，共计40个循环。结果分析：采用2-ΔΔCt相对定量法，确定特定荧光域值对应循环数的Ct值，对目标基因进行定量。引物由上海生工公司进行合成(表1)。

1.4.4 ELISA法检测 酶联免疫吸附实验检测小鼠血清中的可溶性Tim3和Galectin-9水平，严格按照试剂盒的操作说明，终止反应后用酶标仪在450 nm处读取OD值，根据标准曲线计算Tim3和Galectin-9的水平并进行比较，观察其变化规律。进一步检测其他相关细胞因子IFN-γ、IL-12和IL-4的水平，并观察这些细胞因子的变化是否与Tim-3和Galectin-9水平的改变相关或者是否引起相应变化。

表1 引物合成表

1.4.5 流式细胞检测 采用流式细胞仪[9]检测小鼠脾细胞悬液中CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T细胞的表达，用T细胞亚群CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS流式试剂进行检测，获取其百分比数。

2 结果

2.1实时荧光定量PCR检测mRNA结果与对照组小鼠相比较，实验组免疫BCG-EgG1Y162疫苗小鼠外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)中Tim-3 mRNA水平明显降低(P<0.05)，Galectin-9 mRNA水平也明显降低(P<0.05)(表2)。Th1的转录因子T-bet和Th2的转录因子GATA-3 在小鼠的外周血PBMC中也发生mRNA的改变(表3)。

表2 2组外周血PBMC中Tim-3、Galectin-9mRNA表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2ELISA实验检测结果与对照组小鼠血清检测结果相比，实验组免疫BCG-EgG1Y162疫苗小鼠血清中Tim-3水平显著降低(P<0.01)，Galectin-9水平明显降低(P<0.05)(表4)；进一步检测2组小鼠血清中Th1(IFN-γ、IL-12)和Th2(IL-4)的细胞因子水平，IFN-γ和IL-12水平明显增高(P<0.05)、IL-4水平显著降低(P<0.05)(表5)。

表3 2组外周血PBMC中转录因子T-bet和GATA-3的mRNA表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3外周血流式检测结果与对照组相比，实验组免疫BCG-EgG1Y162疫苗小鼠脾细胞中Tim-3+T细胞降低，差异有统计学意义(P<0.05)(表6)。与对照组小鼠相比，实验组小鼠体内CD4+T细胞比例升高，CD8+T细胞比例降低，CD4+T/CD8+T细胞比值升高，差异有统计学意义(P<0.05)(表6)。

表4 2组血清中可溶性Tim-3、Galectin-9表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

表5 2组血清中Th1(IFN-γ、IL-12)和Th2(IL-4)表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

表6 2组小鼠外周血Tim-3+T及CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T细胞的比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

TIM-3(Tcellimmunoglobulindomainandmucindomain-3)是一类T细胞表面抑制性分子，已在相关实验中被证实能够引起癌症与慢性病毒感染过程中T细胞的衰竭[10-12]，其在包虫病感染中的作用也备受学者们的关注，TIM-3被认为在调节Th1/Th2平衡中起着重要的作用[13]。

Th1和Th2细胞分别介导胞内和胞外的针对细菌和虫体的免疫应答[14]，Th1细胞分泌的细胞因子主要有IFN-γ、IL-12和TNF-α等，主要介导机体的细胞免疫应答和抗肿瘤免疫；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子，主要介导机体内的体液免疫应答。IFN-γ已被证明具有诱导促进Th1细胞增殖分化、从而抑制Th2细胞分泌的作用，IL-4则被证明能够促进Th2细胞分泌增加、抑制Th1细胞增殖分化。Th1/Th2细胞之间的平衡受这些细胞因子之间的各种调控，来保证机体免疫功能的正常运转。

前期的实验研究已经证实了在包虫感染的过程中，出现了Th1/Th2细胞的失衡，正是这种免疫失衡的出现，才有利于包虫逃避机体的免疫监测作用，侵入人体大量繁殖形成包虫囊壁，有利于其机体内的寄生，另外一方面，这种失衡的出现也抑制了机体的免疫极化作用，这两种作用共同作用下，进一步导致了包虫感染对人体的侵害。

包虫疫苗是解决包虫病的最优措施，预防远远大于治疗，不仅可以从根本上解决问题，还能大大减少医疗成本[15]，许多学者一直致力于寻找更有效的包虫病疫苗[16]。重组卡介苗(rBCG)在利用基因工程改造的基础上对其基因进行优化，BCG疫苗[17]原本是用来预防小儿结合病的一个高效疫苗，在被改造后具有了载体和免疫佐剂的双重功能，在之前的研究中已被证明能够高效的增强靶抗原的免疫活性，且该疫苗在长期的使用中已经被证明了其安全性和稳定性，接种BCG疫苗一次就能诱导持久性的免疫效果。因此本研究试图了解在对前期已被证明的对预防包虫病有效的EgG1Y162抗原进行BCG的联合后，免疫小鼠后是否引起一系列复杂的免疫因子的变化。

在包虫慢性感染的病人血液mRNA水平的检测结果中我们观察到IL-4、Tim-3及其配体Galectin-9水平的升高，同时IFN-γ、IL-12水平降低，大量的Galectin-9与活化的Th1型细胞表面表达的Tim3分子的糖基侧链特异性结合，进一步诱导Tim3阳性Th1型细胞凋亡[18]，这也是Th1/Th2细胞免疫失衡开始。而本研究通过免疫组小鼠和正常组小鼠的mRNA的实时荧光定量PCR结果的对比研究中发现BCG-EgG1Y162疫苗能够降低Tim-3及其配体Galectin-9水平的高表达，同时上调T-bet的表达水平进而相应细胞因子分泌水平的升高。纠正这些细胞因子的水平，那么也就是能够进一步纠正Th1/Th2细胞的失衡，这对于包虫感染意义重大。在经过Elisa实验检测后发现，该疫苗能够降低IL-4、Tim-3及其配体Galectin-9的升高，用时升高IFN-γ、IL-12水平。

前期的研究中通过检测肝包虫病人血清中的Tim-3及其配体Galectin-9发现其水平的增高可能与Th1相关的细胞因子IFN-γ水平的降低有关，从而导致了Th1/Th2细胞免疫的失衡[8]。本实验在免疫小鼠BCG-EgG1Y162疫苗后，再进行细粒棘球蚴的感染攻击，就是想研究该疫苗是否能够在刺激机体产生免疫应答反应后能有效性的针对包虫的感染下纠正Th1/Th2细胞免疫的失衡。实验证明，在疫苗免疫组中，Tim-3和Galectin-9，GATA-3升高的水平与未免疫小鼠相比有所下降，于此同时，与Th1细胞相关的IFN-γ细胞因子出现上调，进一步也说明了其失衡的情况得到纠正。

综上所述，BCG-EgG1Y162疫苗对免疫新靶点Tim-3及其配体Galectin-9的水平下调，可能进一步纠正了Th1/Th2细胞免疫的失衡，这对包虫病的预防有着重大的意义，为后续的疫苗研究奠定了基础。