黏附与聚集、抗肿瘤及抗菌特性乳杆菌的筛选

宋雨心，王文骞，张 园，刘琳琳，王婷婷，祁小乐，高玉龙，王永强，高宏雷，李 凯，刘长军，张艳萍，高 立，王笑梅*，崔红玉*，何高明

(1.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832002；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队，黑龙江哈尔滨150069)

益生菌广泛分布于自然界中，被定义为“足够量可给予机体健康益处的微生物”(FAO/WHO，2009)，它们大多是可利用碳水化合物产生大量乳酸、安全无毒、无致病性、无致癌性的一类革兰氏阳性细菌，在世界范围内被公认为“GRAS”级(食品安全级)的微生物[1-2]。益生乳酸菌能够促进肠道微生物群落的生态平衡、控制内毒素、抑制肠道病原体如大肠杆菌、沙门氏菌等；调节机体免疫系统，影响宿主健康等[3-4]。李平兰等的研究表明，来自猪和人类粪便的不同种类乳酸菌在体外与人结肠癌细胞系HT-29细胞的黏附能力不同，而HT-29细胞在体外易培养，其形态、黏附能力等与肠上皮细胞类似，能表达正常人肠细胞的形态和某些生理特性，所以常被用于黏附实验[5]。黏附是指细菌与肠上皮细胞通过生物化学作用产生的特异性粘连。乳酸菌对肠道上皮细胞的黏附作用有助于其在肠道定植、增强乳酸菌与肠道细胞之间的信号交流和提高机体的免疫力，因此乳酸菌的黏附特性是评价其是否具有良好调节免疫功能的重要指标，是影响活菌制剂效果的关键因素之一[6-7]。目前抗生素被广泛用于饲料添加剂来预防疾病，促进动物机体生长，降低其死亡率。但随着抗生素的滥用造成的细菌耐药性、药物残留等问题日益突出，严重危害人类健康。因此，寻找能代替抗生素的天然物质刻不容缓，有研究者指出，益生菌可作为最佳的替代品之一，具有增强宿主抵抗力、提高机体健康水平、减少疾病发生等优点[2]。

本研究以10株乳杆菌为研究对象，研究了乳杆菌黏附肠道细胞与抗肠道肿瘤增殖及抗肠道致病菌的作用，筛选出具有强黏附特性及抗肠道肿瘤、抗肠道致病菌的乳杆菌，为活菌制剂的选择、抗肿瘤制剂及替代抗生素制剂等的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与细胞10株乳杆菌(表1)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所益生菌种资源库-80℃保存，均为天然健康(非人工饲养)动物肠道中分离，经过耐酸(pH3.0)、耐胆盐(0.3%)实验筛选和动物饲喂实验验证的益生菌株。标准致病菌株大肠埃希氏菌ATCC25922(Escherichia coliATCC25922)、鸡白痢沙门氏菌 CVCC578(Salmonella pullorumCVCC578)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC 25923)均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；人结直肠腺癌细胞系(HT-29细胞)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。

表1 10株候选乳杆菌菌株Table 1 10 strains of candidate Lactobacillus

1.2 主要试剂MRS培养基购自青岛海博生物科技有限公司；LB培养基购自Invitrogen公司；100×青-链霉素、0.25%胰酶-EDTA、磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)、台盼蓝、4%多聚甲醛购自Life Technologies公司；TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；4',6-二脒基 -2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、羧基荧光素双乙酸盐-琥珀酰亚胺酯(carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)购自Sigma公司。

1.3 乳杆菌的培养及菌悬液的制备乳杆菌菌种按1%体积接种于MRS液体培养基中，于37℃培养18 h后传代，传代培养3次后备用；标准致病菌按1%接种于LB液体培养基，于37℃ 200 r/min摇床中培养18 h备用；离心收集菌体(5 000 r/min，4℃，10 min)，PBS洗涤3次，将菌体用PBS重悬，调整细菌悬液的 OD600nm值至 1±0.05(约为 2×108cfu/mL)备用。

1.4 乳杆菌自聚集能力测试根据Polak-Berecka[8]等和Kos[9]等文献进行自聚集测定：取5 mL 1.3所获得的细菌悬浮液涡旋10 s，并在37℃下静止孵育2 h，测量上清液的OD600nm值。根据下列公式1计算细菌的自聚集率(Ac%)：

公式 1： AC(%)=[1-(A2h/A0)]×100

其中，A0是细菌悬浮液涡旋后测定的初始OD600nm值；A2h是静止孵育2 h后细菌悬液上清的OD600nm值。

1.5 乳杆菌与致病性细菌的共聚集能力测试根据Xu[10]等文献进行共聚集测定：乳杆菌、标准致病菌菌悬液各取2 mL(2×108cfu/mL)等体积混合，涡旋10 s，并在37℃下静止孵育2 h，每个离心管总体积为4 mL。2 h后测定上清液OD600nm值，并根据公式2计算共聚集率(Cc%)：

公式 2：CC(%)=[1-COmix/(COstrain+COpathogen)/2]×100

其中，COmix是混合物培养 2 h后的 OD600nm值，COstrain是乳杆菌的初始光密度OD600nm值，COpathogen是标准致病菌的初始OD600nm值。

1.6 乳杆菌黏附能力的测定HT-29细胞2 d更换一次培养液，3 d进行传代，传代5次后进行后续试验。根据 Zhang[11]等、Duary[12]等和刘东方[6]等的方法进行了改进：将 HT-29细胞以 2×105个 /孔的密度分别接种于6孔板、12孔板中，隔天更换培养液，待其生长至70%～80%进行实验。用PBS(pH7.4)清洗6孔板中的细胞两次。取1 mL乳杆菌菌悬液(OD600nm=1.0，2×108cfu/mL)经 4 000 r/min，离心10 min，用无菌PBS清洗3次后加入1 mL 50 μmol/L的羧基荧光素双乙酸盐-琥珀酰亚胺酯(Carboxy-fluorescein diacetate， succinimidyl ester， CFSE)溶 液 ，于37℃摇床避光培养20 min将细菌着色，随后4 000 r/min，离心10 min收集菌体，用无菌的PBS清洗3次后使用2 mL无血清的DMEM培养基重悬菌体。每孔加入1 mL菌悬液，将6孔板于37℃，5%CO2培养2 h。将所有孔用无菌PBS洗涤4次，并用4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗后，加入0.1%Triton X-100，静置10 min。最后，使用DAPI染细胞核，倒置荧光显微镜下观察结果。

1.7 乳杆菌内化能力的测定根据Cirillo[13]等方法进行改进：用PBS清洗接种于12孔板且生长至70%～80%的HT-29细胞两次，取1 mL乳酸菌悬液(OD600nm=1.0，2×108cfu/mL)，每孔按 MOI为 1 000∶1(细菌与细胞数量的比值)加入细胞培养板中，于37℃，5%CO2共培养 2 h。PBS洗涤细胞 3～4次，除去未黏附的细菌，加入150 μg/mL庆大霉素作用 1 h，每孔加入 0.25%胰酶静置 3 min，加入含10%FBS的DMEM培养液终止消化反应。然后加入0.5%Triton-X100，静置5 min。最后将混合物经一系列10倍连续稀释，接种于固体MRS培养基培养24 h～48 h后进行平板计数。根据公式计算内化率：

1.8 乳杆菌抗HT-29细胞增殖能力的检测根据文献[14-15]，以CCK8试剂盒测定乳杆菌对人结直肠腺癌细胞的抗增殖作用。将浓度为2×104个/100 μL的HT-29细胞接种于96孔板中，37℃ 5%CO2培养24 h后用PBS洗涤细胞2次，每个孔按MOI为100∶1加入OD600nm为1.0的乳酸菌悬液，于37℃5%CO2培养16 h后台盼蓝法检查细胞活力，每孔加入10 μL CCK8试剂，培养4 h后测定OD450nm。根据公式计算细胞增殖百分比：

细胞增殖(%)=[(Ates-Acontrol)/Acontrol]×100

其中Atest为与乳杆菌相互作用的HT-29细胞孔的 OD450nm；Acontrol为仅 HT-29细胞孔的 OD450nm。

1.9 乳杆菌的体外抗菌活性乳杆菌按1%体积接种于MRS液体培养基中，37℃培养18 h，作为待测菌液。将培养18 h的指示菌按0.2%接种于约50℃熔化的LB琼脂培养基中，混合均匀，倒入预先放有牛津杯的培养皿中待其凝固后，取出牛津杯，在每个牛津杯孔中加入200 μL待测乳杆菌培养液，于37℃培养48 h，用游标卡尺测量抑菌环大小。

2 结果

2.1 乳杆菌自聚集能力检测结果对10种乳杆菌进行自聚集能力检测，结果显示，Lac.97菌株具有最强的自聚合能力，达到67.73%，显著高于其它菌株(p＜0.0001)，其次是 Lac.95、Lac.71、和 Lac.99菌，自聚合能力分别为41.84%、32.48%和26.93%。候选菌株 Lac.95、Lac.97、Lac.99、Lac.56、Lac.71、Lac.85等6株乳杆菌的自聚合能力均达到20%以上(图 1)。

图1 10株乳杆菌自聚集能力分析Fig.1 Analysis of auto-aggregation ability of the 10 strains Lactobacillus

2.2 乳杆菌与致病菌的共聚集能力检测结果10株候选菌株与致病菌共聚合能力测试，结果显示10株乳杆菌与致病性大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的共聚集能力均较强，均达到80%以上(图2)。表明本试验中的10株乳杆菌均可共聚集致病菌。

图2 10株乳杆菌与致病菌的共聚集能力比较Fig.2 Comparison of co-aggregation ability between 10 Lactobacillus strains with the pathogenic bacteria

2.3 乳杆菌体外黏附上皮细胞的观察将HT-29细胞与CFSE染色的各乳杆菌菌悬液共培养，于荧光显微镜下观察。结果显示，Lac.99菌株黏附能力最强，其余乳杆菌株对上皮细胞也具有强度不一的黏附性(图 3)。表明10株乳杆菌对HT-29细胞均具有黏附能力。

2.4 乳杆菌内化肠道上皮细胞结果根据平板计数结果显示，菌株Lac.86、Lac.87、Lac.99、Lac.85等4株乳杆菌对HT-29的内化率达到5%以上，其中Lac.99菌株内化率最高，达到14.85%，显著高于除Lac.87外的菌株(p＜0.0001)(图 4)。表明筛选到的Lac.86、Lac.87、Lac.99、Lac.85乳杆菌均具有对肠道上皮细胞较强的内化作用。

图3 乳杆菌Lac.99黏附及内化HT-29细胞Fig.3 Observation of Lactobacillus strain lac.99 adhesion and internalization HT-29 cells

图4 10株乳杆菌的内化能力Fig.4 Analysis of the internalization ability of the 10 Lactobacillus stains

2.5 乳杆菌抗人结直肠腺癌细胞增殖能力的检测结果体外试验结果显示，在10种乳杆菌中，Lac.117、Lac.56菌株具有较强的抗肿瘤细胞HT-29增殖的作用，其中作用最强的是Lac.56菌株，达到49.71%，与 Lac.117相比差异显著(p＜0.05)，而其余乳杆菌菌株对HT-29细胞的增殖影响不明显，差异不显著(图 5)。表明筛选到的乳杆菌株 Lac.117，Lac.56具有较强的抗肿瘤细胞增殖作用。

图5 10株乳杆菌对HT-29细胞的抗增殖能力Fig.5 The anti-proliferation ability of 10 Lactobacillus strains against HT-29 cells

2.6 乳杆菌体外抑菌活性检测结果采用抑菌环试验检测筛选的乳杆菌体外抑菌活性，结果显示，10株乳杆菌对致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌及金黄色葡萄球菌均有抑制作用，其中Lac.117菌株对3种致病菌的抑制作用均最强，抑菌环直径分别为16 mm、17 mm和 15 mm(表 2)。表明本研究筛选的乳杆菌均具有不等的抑菌活性。

表2 乳杆菌对致病菌的抑制活性Table 2 Inhibition activity of Lactobacillus against pathogenic bacteria

3 讨论

据报道乳酸菌自聚集能力与其黏附能力密切相关，研究表明自聚集能力强的乳酸菌往往具有较强的黏附肠道上皮细胞的能力，因此测定乳酸菌自聚集能力是筛选其黏附特性的首要指标[16]。只有当乳酸菌黏附于肠上皮细胞表面时，才能定植于肠道上皮细胞表面，有效发挥其抑制致病菌侵袭肠粘膜的生物屏障的功能[17]。肠道黏膜上皮细胞中、黏膜固有层以及派伊尔氏结(PP)中分布有许多免疫活性细胞，部分分布在上皮之间，据相关研究报道，细菌的黏附和内化与这些黏膜免疫细胞密切相关，乳杆菌的内化是其发挥免疫调节作用或运载特定抗原到达效应部位的前提[18-21]。

本研究通过体外肠道上皮细胞模型测试了10株乳杆菌的黏附能力及其抗肿瘤、抗致病菌能力。结果显示，10株乳杆菌中，60%的乳杆菌自聚集能力达到20%以上。其中lac.97菌株自聚集能力最强达到67.73%，高于Abbasiliasi[16]等报道的乳杆菌自聚集能力(35.2%)，表明lac.97乳酸菌具有高黏附特性，高黏附特性益生菌的获得为将来益生菌的抗菌活性研究，以及乳杆菌免疫调节剂的研究奠定重要的基础。通过显微镜下观察10株乳杆菌对肠道HT-29细胞不仅具有黏附性而且可通过细胞膜内化进入细胞内。lac.97菌株自聚集能力强但内化能力较弱，而lac.117菌自聚合能力与lac.97菌相比较低，但lac.117内化能力很强，表明自聚集能力与黏附和内化能力不一定成正相关。经平板计数测定Lac.117内化率，可达到14.85%，与显微镜观察到的结果一致，lac.117的内化率较Cirillo[13]等报道的乳杆菌的内化率更高，提示lac.117可能具有更强的抗原递送潜力。

此外，本研究通过抑制肿瘤细胞生长和细胞活力来验证乳杆菌的抗肿瘤作用，结果显示lac.117和lac.56乳杆菌对人结直肠腺癌HT-29细胞的生长均具有较强的抑制作用，其抗增殖能力分别达到27.15%和49.71%，该结果与Grimoud J[15]描述的一致且抑制能力更强。研究报道乳酸菌抑制病原菌的能力和其与病原菌共聚集能力有关，本研究显示10株乳杆菌与病原细菌的的共聚集能力相当[9-10]，差异不显著，但体外抑菌试验表明lac.117对致病菌大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力最强。通过比较分析10株乳杆菌的黏附特性、抗致病菌特性和抗肿瘤细胞增殖特性，显示这些菌株不能同时在所有益生特性指标上表现优秀，即不同乳杆菌的益生特性千差万别，一株益生菌不能同时具有各种益生特性，这一结果与前人的研究结果一致[22]，可能这与它原本的生活环境、产生不同的副产物、生物特性以及其他因素等有关，但综合以上结果可见Lac.56各方面特性均较好。