黄瓜响应低温胁迫的生理及分子机制研究进展

李彩霞 董邵云 薄凯亮 苗 晗 张圣平 顾兴芳

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黄瓜（Cucumis sativusL.）起源于喜马拉雅山南麓的热带雨林地区，喜温暖但不耐寒冷，属典型的冷敏感型植物（安志信 等，2006）。黄瓜是重要的经济作物之一，我国是世界上黄瓜栽培面积最大的国家，且在北方地区反季节栽培面积不断增加。黄瓜的适宜生长温度范围为：白天25～30℃，夜间13～15 ℃（李会敏，2016）。但我国北方地区冬春季黄瓜栽培中普遍存在长期偏低温（＜20 ℃/8～12 ℃，昼/夜）和短期临界低温（15℃/4～8 ℃，昼/夜）的问题（王永健 等，2005）。黄瓜各器官组织均对低温敏感（Cabrera et al.，1992），低温胁迫对黄瓜不同发育阶段都会产生不同程度的危害，如种子发芽率降低，苗期叶片边缘黄化、枯死和内卷，开花期受精率下降，结果期坐果率下降，化瓜、畸形瓜严重，贮藏和运输期果实易发生腐烂，品质下降（郝敬虹 等，2009；王红飞 等，2016），低温胁迫已成为制约黄瓜丰产、优质的重要逆境因素。因此，通过研究低温胁迫对黄瓜生理生化方面的影响，挖掘黄瓜的耐寒基因，探索提高黄瓜低温耐受性的有效措施，将为解决黄瓜低温冷害问题、培育耐低温黄瓜新品种提供重要的参考依据。

1 黄瓜响应低温胁迫的生理生化基础

低温胁迫下，黄瓜能通过影响膜系统组分的变化、激活活性氧清除系统、调节激素含量和渗透调节物质以及影响光合特性等生理生化机制来适应低温环境（Ruelland et al.，2009；李猛 等，2018）。

1.1 膜系统组分

细胞膜是进行生命活动的重要场所，作为渗透屏障参与物质运输、能量转换、蛋白质合成和跨膜信号的识别与传递等。冷害的根本原因是细胞膜系统受损，“膜脂相变”学说表明，细胞膜首先感应低温信号并作出一系列的生理反应，如膜结构发生改变，产生丙二醛，从而影响其他正常代谢的进行（李晓靖和崔海军，2018）。

1.1.1 膜结构的改变 低温胁迫会导致生物膜发生相变和结构上的变化。膜由液晶态转变为凝胶态，膜脂中不饱和脂肪酸的含量下降，膜流动性下降，从而导致细胞质液泡化，离子大量外渗，通透性增加，膜结合酶活性降低，呼吸受阻，能量供应不足，细胞代谢变化和细胞功能紊乱 等，植物耐寒性降低（Lyons et al.，1979）。Shi等（2008）研究发现黄瓜的亚麻酸（C18：3）、棕榈酸（C16：0）、油酸（C18：1）、亚油酸（C18：2）和硬脂酸（C18：0）与黄瓜的耐低温性密切相关。低温处理的黄瓜子叶中，双半乳糖甘油二酯（DGDG）含量明显升高，而磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）含量显著降低，DGDG和PC不饱和度增多，从而C18：3显著增多（杨玲，2001）。

1.1.2 膜代谢产物的产生 低温胁迫条件下膜脂过氧化的终产物丙二醛（MDA）是衡量黄瓜耐低温性的一个重要指标（周双 等，2015）。MDA可与蛋白质或核酸大分子之间发生交联、聚合，导致酶失活，对细胞起毒害作用（Rihan et al.，2017）。MDA含量与低温胁迫程度呈负相关，不同低温处理黄瓜幼苗，处理温度越低，膜脂过氧化程度越重，MDA含量越高，抗寒性越差；黄瓜幼苗的耐冷性越强，MDA含量越低（田明刚，2005；方媛 等，2016）。

1.2 保护酶系统

活性氧具有很强的氧化能力，活性氧的大量积累导致细胞伤害。正常情况下，细胞内自由基的产生和消除处于平衡状态。低温胁迫下，植物体内保护酶如超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化物酶（POD）、愈创木酚过氧化物酶（GPX）的活性提高，通过保护酶活性的提高来减少活性氧的积累，从而减轻对植物的伤害（Lee & Lee，2000）。黄瓜幼苗在低温胁迫恢复过程中，其保护酶（SOD、POD、CAT、APX）的活性先升高后降低，且不同基因型差异较大（吴燕 等，2018）。于锡宏等（2011）采用不同的低温胁迫方式处理黄瓜幼苗，渐降低温胁迫（以每小时下降 1 ℃的平均速度进行降温处理）与直降低温胁迫相比，其保护酶（SOD、POD、CAT）活性显著增强，冷害指数降低，黄瓜幼苗受冷害的程度减缓。

1.3 激素含量

激素与植物耐寒性有着密不可分的关系。张颖等（2012）研究发现：外源喷施脱落酸（ABA）可以缓解低温下黄瓜幼苗中POD、SOD活性的增加和CAT活性的降低；外源ABA施用量与植物的耐寒性呈正相关。董春娟等（2017）发现水杨酸（SA）既可增强黄瓜幼苗叶片光合作用和活性氧的清除，又可诱导黄瓜幼苗根系FAD基因表达，提高黄瓜幼苗抗寒性。叶面喷施Ca2+可以通过影响ABA和SA的含量，从而影响黄瓜幼苗的耐冷性（杨楠 等，2012）。王丽丽和于锡宏（2004）的研究表明，低温胁迫程度与黄瓜体内赤霉素（GA）和生长素（IAA）的含量呈正相关；随着低温时间的延长，GA和IAA含量先升高后降低。内源PAs（多胺）可以通过阻止线粒体中NADPH氧化酶的低温诱导活性来增加黄瓜对低温的耐受性（Shen et al.，2000）。外源施用PAs后，低温胁迫下黄瓜幼苗中的GPX活性上升，SOD和CAT的活性略有下降，从而影响了黄瓜对低温的应激能力（Kubiś，2008）。

1.4 渗透调节物质

渗透调节物质能够维持细胞膨压和气孔开放，保证生理生化过程和光合作用正常进行。渗透调节物质主要包括无机物质（K+、Ca2+等）和有机物质（脯氨酸、可溶性糖等）。渗透调节物质与低温胁迫具有明显相关性。刘洁等（2015）研究表明黄瓜的耐低温性与叶片中K的质量分数呈正相关。脯氨酸含量是评价植物耐寒性的一个重要指标（Kishor et al.，2005）。田雲等（2017）研究表明低温胁迫下黄瓜中脯氨酸的积累量明显上升，且不同品种间有明显差异。可溶性糖（蔗糖、果糖、棉子糖、水苏糖等）可以提高细胞液浓度，降低细胞水势和冰点，增强细胞持水能力和渗透调节能力，防止细胞脱水过度，提高细胞耐冷性，降低低温对细胞的伤害（崔国文，2009）。苏正楠（2017）研究表明可溶性糖的含量与黄瓜的抗寒指数呈正相关。黄瓜中转录因子ICE1过量表达可诱导冷胁迫基因的表达，促进可溶性糖和游离脯氨酸的积累，抑制丙二醛（MDA）的积累，从而提高黄瓜的耐冷性（Liu et al.，2010）。

1.5 光合特性

光合作用对黄瓜正常的生命活动起着重要的作用。孙世君（2018）研究表明，低温胁迫不仅使黄瓜叶片的叶绿素含量（SPAD）降低，同时使叶片的净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度均随温度的下降而降低，但光能利用率相对较高。Hutchison等（2000）研究表明，低温破坏Rubiso蛋白的完整性，叶片光合作用所需的Rubiso酶活性降低，光合能力下降，有机物的合成减少。邢潇晨等（2017）研究表明，500～800 μmol·L-1的 DNA 甲基化抑制剂5-aza C处理黄瓜幼苗能够显著降低叶片细胞膜透性，提高叶片的净光合速率，从而提高黄瓜幼苗的耐冷性。

2 植物响应低温信号的分子转导机制

植物在遭受低温胁迫时，低温信号在细胞膜上被受体识别、在细胞质内转导、并在细胞核内产生一系列的调控应答，从而调控耐冷基因表达，以增强植物耐低温胁迫的能力（许英 等，2015）。

2.1 细胞膜感受低温信号

细胞流动假说认为在低温条件下，细胞膜上的感受器感受低温信号，引起细胞膜的流动性下降，膜蛋白构象发生改变，细胞骨架由微管和细丝状变为束状发生重排，从而诱导冷诱导基因BN115的大量表达，提高GTPase的活性，激活细胞膜上的钙离子通道打开，钙离子从细胞外流入细胞质（Plieth et al.，1999；Sangwan et al.，2010）。

2.2 低温信号从细胞膜到细胞核的转导

Ca2+是响应低温信号的主要第二信使，Ca2+与信号转导因子钙结合蛋白结合，激活蛋白激酶（MAPKs）级联系统，调节蛋白质的磷酸化和去磷酸化，从而将低温信号从细胞质传到细胞核（Kudla et al.，2018）。其中参与信号转导的主要钙结合蛋白有钙调素（CaM）、钙依赖蛋白激酶（CDPKs）、钙调磷酸酶（CALs）等（Zhu，2016）。

2.3 低温信号在细胞核内的调控

目前低温信号在细胞核中的转导机制在拟南芥和水稻中研究较多（Ding et al.，2019）。

在拟南芥中，冷信号在细胞核内的调控主要有2种途径：一是通过MAPKs级联系统激活细胞核中的核心转录因子ICE1，丝裂原活化蛋白激酶3（MPK3）和丝裂原活化蛋白激酶6（MPK6）通过磷酸化ICE1以破坏ICE1蛋白的稳定性，从而负调控冷调控基因CBF/COR的表达（Chinnusamy et al.，2007；Li et al.，2017）；二是低温条件下，PP2C型E家族蛋白磷酸酶家族（EGR2）豆蔻酰化修饰后与N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT1）互作减弱，使得植物合成大量新的非豆蔻酰化修饰的EGR2（u-EGR2），u-EGR2干扰豆蔻化修饰的EGR2（m-EGR2）与 OST1（Open stomata 1）蛋白激酶的互作，激活OST1，OST1磷酸化转录因子ICE1并稳定ICE1蛋白，正调控CBF/COR基因的表达，从而提高植物的耐冷性（Ding et al.，2015，2018a）。

在水稻中，低温信号在细胞核内的调控主要有3种途径：一是活性氧（ROS）的积累引起MAPKs级联系统调节OsbHLH002（ICE1同源蛋白）的活性，促进其靶基因OsTPP1在低温下表达并将海藻糖-6-磷酸转化成海藻糖（Zhang et al.，2017）；二是通过Ca2+信号诱发转录因子OsMYB3R-2、OsMYBS3和OsMADS57过量表达，在转录水平上提高水稻的耐冷性（Ma et al.，2009；Su et al.，2010）；三是ABA的积累诱发ABA信号通路打开（Ding et al.，2018b）。以上三种途径共同提高水稻的耐寒性。

目前，低温信号的分子转导机制在黄瓜中的研究较少，且尚不清楚。但国内外对黄瓜耐低温胁迫分子机制的有关报道为进一步研究黄瓜的低温应答提供了重要的理论依据。

3 黄瓜耐低温胁迫的分子机制

3.1 黄瓜耐低温遗传规律和基因定位研究

重要农艺性状的基因定位是进行基因克隆和作物遗传改良的基础。作物的耐低温能力很大程度上取决于遗传因素。目前，很多作物中已经定位及克隆了耐寒基因，比如拟南芥的cor78（Horvath et al.，1993）、大麦的pT59和pAO86（Cattivelli & Bartels，1990）、水稻的qLTG3-1（Fujino & Sekiguchi，2011）、玉米的GRMZM2G325653（Hu et al.，2016）等。但在黄瓜中与低温相关的基因还未得到克隆。

有关黄瓜耐低温的遗传学研究表明，控制低温下黄瓜发芽能力（相对发芽势、相对发芽指数、相对胚根长度）的遗传符合加性-显性模型，以显性效应为主（纪颖彪 等，1997；顾兴芳 等，2002）。目前对黄瓜芽期的耐低温基因定位已有研究，Song等（2018）以65G（芽期低温敏感型）和02245（芽期耐低温型）为亲本构建重组自交系，通过两次的遗传分析表明芽期耐低温符合数量遗传，以127对SSR分子标记对RIL群体构建遗传连锁图谱，检测到3个与低温相关的主效QTL位点：与低温下发芽能力相关的位点qLTG1.1和qLTG2.1，与低温下胚根伸长相关的位点qLTG4.1。

对黄瓜苗期的耐低温基因定位也有报道，李恒松等（2015）以0839（黄瓜耐冷型品系）和B52（低温敏感型品系）为亲本，构建6世代群体，遗传分析表明幼苗耐冷基因受显性单基因控制，通过对F2群体集群分离分析（BSA），将黄瓜幼苗耐冷性主效基因定位于黄瓜遗传图谱第6连锁群上，与分子标记SSR07248的遗传距离为32.6 cM。王红飞（2014）以QT193（苗期低温敏感型）和JD32（苗期耐低温型）为亲本，构建F2遗传群体，遗传分析表明苗期耐冷基因符合数量性状遗传，以75对分子标记构建连锁遗传图谱，共检测到4个与苗期耐低温相关的位点，其中3个与冷害指数相关的位点（qCT-3-1、qCT-3-2、qCT-3-3）位于3号染色体，1个与恢复指数相关的位点（qCT-7-1）位于7号染色体。

3.2 黄瓜耐低温相关基因及功能研究

目前在研究中发现多个基因的表达与黄瓜耐冷性密切相关。陈珊等（2015）发现CsHSF7和CsHSF11基因的表达水平与黄瓜果实耐冷性密切相关，且CsHSF11在酵母中具有转录激活活性；董洪霞等（2017）发现黄瓜中参与转录调控的Csa5M608380基因后期过量表达可能提高黄瓜的耐冷性。将甘氨酸丰富RNA结合基因CsGR-RBP3或G蛋白Gγ亚基的同源基因CsGG3.2过表达，活性氧清除系统加强，CAT和SOD活性提高，黄瓜幼苗的低温伤害指数降低，黄瓜的耐寒性增强（Bai et al.，2018；Wang et al.，2018）。黄瓜中不同基因的表达水平对黄瓜低温适应起重要作用，低温诱导下黄瓜叶片中水苏糖合成酶基因（STS I、STS Ⅱ）（吕 建 国，2017）、α-半乳糖苷酶基因（AGA2、AGA3）（陆慢，2018）、根系FADs基因（CsFAD3、CsFAD7）（Dong et al.，2016）表达量上升；但根系的CsFAB2.1、CsFAB2.2、CsFAD5表达量下降（Dong et al.，2016）。

3.3 黄瓜中与低温信号转导机制相关的研究

黄瓜中与低温相关的转录因子主要有AP2和WRKY家族。黄瓜AP2家族中有162个CBF基因。ABA的积累可以激活黄瓜幼叶中冷诱导基因CBF1的表达，提高黄瓜的耐冷性（Talanova et al.，2008）。黄瓜中有55个WRKY基因（CsWRKY），通过RT-PCR技术显示CsWRKY21、CsWRK23、CsWRKY32、CsWRKY33、CsWRKY42、CsWRKY46和CsWRKY53等7个基因与黄瓜低温胁迫有关，其中CsWRKY21、CsWRKY23在低温条件下表达量上升（Ling et al.，2011；张颖，2012；张颖 等，2017）。低温胁迫下，黄瓜细胞核中的CsWRKY46基因响应低温信号并过量表达，引起ABA含量的变化，CsWRKY46和ABA可能共同调节ABI5基因的表达，进而调节冷调控基因COR47、RD29A和KIN1表达，提高黄瓜的耐寒性（Zhang et al.，2016）。

目前黄瓜耐低温基因功能的研究仅仅停留在转录水平层面，对于酶活性如何受低温影响以及它们参与低温响应的分子机理尚需进一步研究。因此，探究黄瓜耐低温响应途径及调控因子的研究对于黄瓜耐低温胁迫反应的分子机制研究具有非常重要的意义。

4 提高黄瓜低温耐受性的主要措施

大量研究表明可以从多个方面提高黄瓜对低温的耐受性。苗期经过一段时间的低温锻炼可以提高其抗寒力（John et al.，2016）；提高营养液中微量元素（如Mo、Mg）的含量可以增强黄瓜幼苗的壮苗指数、渗透调节能力、抗氧化能力和氮代谢，减轻低温对黄瓜幼苗光合机构的伤害，从而提高幼苗的耐冷性（蔡欢，2014；黄红荣 等，2017）；黄瓜幼苗叶面喷施外源物质，如渗透调节物质（CaCl2、甜菜碱）（毕焕改 等，2015；李阳 等，2015）、激素类物质（ABA、SA、GA）（白龙强 等，2016）、H2S（周超凡 等，2016）、GABA（γ-氨基丁酸）（黄娟 等，2014）、亚精胺（SPD）（李彬，2017）可以提高低温耐受性；加强耐低温砧木的筛选和改进嫁接技术，选择合适的南瓜品种作砧木进行嫁接换根，可以促进低温胁迫下接穗的生长，提高黄瓜的低温耐受性（Xu et al.，2017）。

以上途径是从外源提高黄瓜的低温耐受性，而培育好的黄瓜品种可以从内源提高黄瓜的耐寒性。育种工作者根据实际生产需求，通过挖掘耐冷基因和种质资源等途径培育出耐低温新品种，如中农26号、博耐30号、津优35号、津优36号等（顾兴芳 等，2010；李平，2013；李静 等，2019），从根本上提高黄瓜耐寒性。

5 展望

当今全球气温变暖，海平面上升，极端天气频发，低温冷害已经严重影响植物的生长和发育，给黄瓜的产量、品质等带来了极大的损失。研究黄瓜耐低温的分子机制，选育低温耐受的优异黄瓜种质是解决这一问题的最有效途径。

随着黄瓜基因组测序的完成及大量分子标记的开发，利用黄瓜全基因组分析，对黄瓜果实品质的相关性状已有大量研究（Huang et al.，2009），而对黄瓜耐冷基因的挖掘仅仅停留在芽期和苗期耐低温性状的遗传分析和基因定位阶段，对成株期和果实期的耐低温性研究较少；此外，关于响应低温胁迫的基因研究尚停留在转录水平，尚未见黄瓜耐低温基因的分子克隆及响应低温胁迫的信号通路研究。今后可以加强以下几个方面的研究：① 进一步完善黄瓜芽期、苗期、成株期耐低温评价方法；② 广泛收集并系统鉴定国内外黄瓜种质资源，挖掘耐低温的优异种质；③ 对黄瓜中参与抗逆的转录因子家族如AP2家族和WRKY家族进行系统研究，找到调控低温胁迫响应的转录因子；④ 以模式植物拟南芥和水稻中的低温信号通路为参考，挖掘黄瓜中参与低温胁迫响应信号通路的关键因子，构建黄瓜响应低温胁迫的信号通路模型；⑤ 挖掘耐低温基因，用基因编辑等生物技术手段创制新的耐低温材料。