探讨钙敏感受体及紧密连接蛋白-14在大鼠肾草酸钙结石形成中的作用

李朋，高存祥，王勤章，钱成，徐浩，申茂磊，郝志强，傅家豪，钱彪

(1.石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，新疆 石河子 832000 2.解放军69235部队卫生所，新疆 奎屯 833200)

泌尿系结石是泌尿系统最常见的疾病之一，常发部位为肾脏，其发病原因和发病机制目前尚不明确。肾脏部位的结石主要为草酸钙等含钙结石[1-2]，有研究表明，钙的代谢异常是导致含钙尿路结石形成的重要因素之一，高钙尿引起尿液相对过饱和诱发了含钙结石的形成[3]。钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)可通过上调髓袢升支粗段(thick ascending limb，TAL)紧密连接蛋白-14(Claudin-14)的表达，使肾小管TAL钙的重吸收受到抑制，尿钙排泄率增加，进而形成高钙尿诱发了含钙结石的形成[4-5]。据此推测：CaSR及Claudin-14在大鼠肾草酸钙结石的形成过程中扮演着重要的角色。本研究对CaSR及Claudin-14在草酸钙结石形成过程中表达水平的改变进行动态观察，对两者在结石形成中的作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性Wistar大鼠60只，6周龄左右，体质量(210±15)g，购自新疆医科大学实验动物中心〔合格证号SCXK(新)2013-0001〕。多功能光学显微镜及图像采集系统(BX40，日本Olympus公司)，CaSR抗体(Abcam公司)、Claudin-14抗体(英国Abcam公司)。

1.2 大鼠肾结石模型的建立及实验分组

参照孙稳等[6]的方法制作大鼠肾结石模型。适应性喂养1周后，按照随机数字表法将60只SPF级雄性Wistar大鼠分为空白对照组与结石组，每组各30只。空白对照组给予正常饮水加每日每只2 mL灌胃两周；结石组给予1%乙二醇饮水和2%氯化铵每日每只2 mL灌胃两周。1～10周，每组每周处死3只大鼠，并取其双侧肾脏为标本。

1.3 肾组织HE染色

将一部分石蜡包埋后的肾组织标本制成切片，将切片固定于载玻片上，常规HE染色切片，光学显微镜下观察结晶的形成情况及肾脏病理改变，并按照文献[7]提供的肾脏结晶分级判定标准进行统计，0级判定为阴性结果，表示肾组织内未发现有结晶形成；Ⅰ-Ⅳ级判定为阳性结果，分别表示肾组织内结晶形成的程度。

1.4 免疫组织化学检测

CaSR及Claudin-14的表达：选取成功建立模型的一部分肾组织做免疫组织化学染色。免疫组化采用SP法，石蜡包埋后切片4 μm，常规脱蜡，H2O2处理清除内源性过氧化物酶，枸缘酸缓冲液抗原修复，血清封闭。滴加CaSR抗体(1∶150) 和Clanudin-14抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜，滴加二抗，DAB显微镜下控制显色，苏木素复染，不同浓度酒精和二甲苯脱水，树胶封片，显微镜下观察1～10周两组Wistar雄性大鼠肾脏CaSR和Clanudin-14免疫组织化学染色情况。

2 结果

2.1 肾组织HE染色

光学显微镜下观察，造模期间正常对照组大鼠肾组织冰冻切片内未见结晶沉积，无病理学改变(图1A)。第2周起结石组部分大鼠肾脏可见肾小管上皮细胞脱落或肾间质淋巴细胞浸润，及数量不等透明晶体，多数晶体以不规则碎片出现于肾小管中，部分见于集合管、间质及被膜下，并伴有部分肾小管扩张、上皮细胞空泡样变性及小管上皮肿胀。第5～10周肾组织结晶量多，细胞排列紊乱，肾小管多畸形，肾小管管腔扩大或因上皮细胞肿胀而变窄，扩大腔内多有坏死脱落样物，肾小球多有形状不规则甚至坏死，以肾小管内为著(图1B)。

2.2 肾脏结晶形成及分级

正常对照组大鼠肾组织未见结晶。第3周起结石组大鼠肾脏切片可见明亮晶体，主要分布于远曲小管，近曲小管及部分肾小球周围，形态不规则，晶体多呈零星散在分布，少量晶体呈互相连接成片或成堆，结石组与正常对照组之间成石率差异具有统计学意义(P<0.05)(因结石组大鼠在第3周开始成石，而前两周已处死的大鼠也存在成石的可能，所以在计算成石率时将两组内前两周已处死的大鼠排除在大鼠总计数之外)。见表1。

表1 两组大鼠肾组织结晶分级

*P<0.05，与对照组成石率比较。

2.3 肾组织CaSR免疫组织化学检查结果

光学显微镜下观察到，第1～2周结石组与对照组大鼠肾组织均有CaSR的表达但没有明显差异，主要定位于肾小管上皮细胞的细胞膜上，呈棕褐色；第3～10周对照组大鼠肾组织CaSR的表达较第1～2周无明显变化，但结石组大鼠肾组织CaSR的表达强度则逐渐增强且明显高于对照组，镜下可见结石组肾组织CaSR呈高度表达且弥漫分布。见图2。

2.4 肾组织Claudin-14免疫组织化学检查结果

1～10周在对照组大鼠肾组织中均未能检测到有Claudin-14的表达；结石组在第1～2周也未在大鼠肾组织中发现有Claudin-14的表达，但在第3～10周则观察到在大鼠肾小管髓袢升支粗段有Claudin-14的表达，且表达强度在持续增加。见图3。

3 讨论

泌尿系结石是泌尿外科最常见的疾病之一，是导致尿路梗阻和感染的主要原因。泌尿系结石的结石成分主要有草酸钙、尿酸、磷酸钙草酸钙混合物、鸟粪石及胱氨酸结石，其中以草酸钙结石等含钙结石最为多见[8-10]。尿液中游离钙增高是泌尿系结石形成的主要危险因素[11]，高钙尿使尿液相对过饱和从而诱发了含钙结石的形成。有研究[6]发现，在高钙尿性肾结石形成过程中可能存在一个CaSR-Claudin-14调控通路，其可通过促进尿钙排泄参与泌尿系含钙结石的形成。钙敏感受体(CaSR)是G蛋白偶联受体(GPCR)家族的一员，在调节全身Ca2+的动态平衡中起主要作用[12]。有研究表明，CaSR在肾脏中表达于肾小管髓袢升支粗段(TAL)[13]，激活后通过改变细胞旁途径的渗透性来降低肾小管髓袢升支粗段对钙的重吸收。紧密连接蛋白(Claudins)是紧密连接结构的膜蛋白，其在上皮细胞中的旁细胞途径中既起到孔隙又起阻碍作用。在肾脏中，claudins决定沿着肾小管的不同肾单位片段的渗透性和选择性。在髓袢升支粗段，claudins对钙的重吸收是非常重要的，并受到钙敏感受体的严格调控[14]。紧密连接蛋白-14(Claudin-14)是紧密连接蛋白家族的一员，在肾脏中严格定位于肾小管的髓袢升支粗段(TAL)[14]，可通过调节细胞旁途径的紧密连接蛋白-16和紧密连接蛋白-19构成的阳离子通道渗透性调节肾小管对钙的重吸收。有研究发现通过激活小鼠肾组织的CaSR，Claudin-14蛋白表达显著增高，且尿钙的排泄也发生了相应程度的增加[4]，证实CaSR在髓袢升支粗段(TAL)主要是通过调节下游Claudin-14蛋白的表达来抑制钙的重吸收，同时，肾脏TAL的Claudin-14的表达主要受该处CaSR的调控。由此说明泌尿系草酸钙结石等含钙结石的形成与肾组织中CaSR及Claudin-14蛋白的表达有着紧密的联系。

本研究中，第1～2周HE染色结果分析发现结石组与对照组大鼠肾组织的病理改变无差异，免疫组化显示第1～2周两组大鼠肾组织CaSR表达水平无明显差异且在两组大鼠肾组织中均未有Claudin-14的表达。第3周开始HE染色可见结石组大鼠肾脏切片有明亮晶体；免疫组化观察到第3周开始到第10周CaSR的表达程度逐渐增强且明显高于对照组，同时开始发现有Claudin-14的表达且表达强度在逐步增加。而第3～10周对照组大鼠肾组织HE染色结果以及肾组织中CaSR的表达水平与第1～2周相比并未发生明显改变。有研究发现Claudin-14基因在正常肾脏中不表达，通常在饮水过少或摄入钙过多时表达[15]，这与本研究结果一致：在对照组大鼠肾组织中未发现有Claudin-14的表达。

CaSR和Claudin-14表达水平的改变说明二者在大鼠肾组织含钙结石的形成过程中起着至关重要的作用，其作用机制可能是通过激活肾组织中的CaSR，从而引起其下游Claudin-14高度表达，Claudin-14可以阻断由Claudin-16和Claudin-19构成的细胞外阳离子通道[16]，使肾小管髓袢升支粗段上皮细胞膜上离子通道的渗透性发生改变，导致该部位Ca2+的重吸收障碍[17]，Ca2+的排泄增加[18]，最终尿路中出现大量的Ca2+累积，大大增加了形成结石的可能性。

综上所述，CaSR和Claudin-14的表达强度在大鼠草酸钙结石形成过程中存在动态改变，这种动态的改变在结石形成过程中起着非常重要的作用，之后将进一步探讨泌尿系含钙结合的形成机制，为临床治疗提供有力依据。