合江佛手两种香豆素含量测定及指纹图谱研究

刘盼，雷素娟，何兵，田吉，*

（1.西南医科大学药学院，四川泸州646000；2.西南医科大学附属医院，四川泸州646000）

佛手，为芸香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥成熟果实[1]，又称佛手柑、五指橘、五指柑等。据《本草纲目》[2]记载，佛手柑“下气，除心头痰水；煮酒饮，治痰多咳漱；煮汤，治心下气痛。”佛手药食同源，除用作药材外，经加工还可制成多种保健食品（如蜜饯、果脯等）及保健饮料（如佛手茶、佛手蜜、佛手酒等）[3]。佛手主要成分为香豆素、黄酮类挥发油及橙皮苷等[4-6]，现代药理研究表明其具有抗氧化[7]、抗抑郁[8]、祛痰平喘[9]、抗肿瘤及抗HIV活性[10-11]等多种作用。

在中国药典2015版佛手项下收载了以药材为对照的薄层鉴别、醇溶性浸出物和橙皮苷的含量测定项，而佛手中的另一类特征性香豆素类化合物却未得到体现。近年来佛手在国内外市场的需求量日益增大，但因药材种类较多，来源复杂，造成目前品种混乱、质量参差不齐的现象。现国内佛手主流品种为广佛手（广州产）、川佛手（四川产）及金佛手（浙江产）[12-13]。四川省合江县是川佛手的历史产区，产量曾达到全省15%，是川佛手的重要组成部分。综合评价合江佛手质量，对于川佛手的质量控制具有重要意义。为保证临床用药的准确性和安全性，提高佛手药材的质量控制标准，以四川合江产佛手为主要研究对象，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），同时测定合江佛手中5，7-二甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素的含量，并建立合江佛手的HPLC指纹图谱。

1 仪器与试药

1.1 仪器

戴安（P680A）高效液相色谱仪（含四元泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站）：Dionex Softron GmbH；AS7240A超声清洁机：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；XR 205SM-DR电子天平：瑞士Precisa公司。

1.2 试剂

5，7-二甲氧基香豆素对照品（批号：00003666-2423，经HPLC峰面积归一化法检测纯度在98%以上）：美国ChromaDex.Inc；6，7-二甲氧基香豆素对照品（批号：111740-200501，经HPLC峰面积归一化法检测纯度在98%以上）：中国药品生物制品检定所；乙腈（色谱纯）：上海星可生化有限公司；水为重蒸馏水。

1.3 原料

原料来源见表1，所有原料经西南医科大学药学院庄元春副教授鉴定为芸香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥成熟果实。

表1 佛手产地来源Table 1 The source information of FCS

2 方法与结果

2.1 5，7-二甲氧基香豆素与6，7-二甲氧基香豆素的含量测定

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Besil C18-B（5 μm 250 mm×4.6 mm）；流动相：A-乙腈，B-水，梯度洗脱条件：0～11 min，B（55%），11 min～15 min，B（55%～5%），15 min～16 min，B（5%～55%），16 min～22 min，B（55%）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：326 nm；柱温：30℃。在选定色谱条件下，佛手中5，7-二甲氧基香豆素峰、6，7-二甲氧基香豆素峰与其前后色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数大于4 000。同时取乙腈进样，结果表明溶剂无干扰。对照品及样品色谱图见图1。

图1 对照品（A）及样品（B）色谱图Fig.1 Chromatogram of reference substances（A）and sample（B）

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称定佛手样品1 g，置锥形瓶中，依次加入50 mL、30 mL 75%甲醇，超声 30 min，放冷过滤，合并两次滤液，水浴蒸干，残渣加入乙腈定容至10 mL。

2.1.3 对照品溶液的制备

分别精密称取5，7-二甲氧基香豆素及6，7-二甲氧基香豆素对照品适量，置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得对照品储备液（5，7-二甲氧基香豆素：0.534 mg/mL，6，7-二甲氧基香豆素：0.572 mg/mL）。精密量取5，7-二甲氧基香豆素贮备液1 mL及6，7-二甲氧基香豆素贮备液0.1 mL，加乙腈定容到5 mL，即得混合对照品溶液。（每1 mL含6，7-二甲氧基香豆素0.011 44 mg，5，7-二甲氧基香豆素0.106 8 mg）。

2.1.4 线性与范围

精密量取2.1.3项下2种对照品储备液，加乙腈制备出6份混合对照品溶液，每1 mL分别含5，7-二甲氧基香豆素 0.013 35、0.026 7、0.053 4、0.106 8、0.213 6、0.427 2 mg，含 6，7-二甲氧基香豆素 0.001 43、0.002 86、0.005 72、0.011 44、0.022 88、0.045 76 mg。分别精密吸取各浓度对照品溶液10 μL进样，按2.1.1项下方法测定峰面积，以峰面积值A对进样量C（μg）进行回归，得出下列标准曲线方程。结果表明，6，7-二甲氧基香豆素进样量在 0.014 3 μg～0.457 6 μg 范围内，5，7-二甲氧基香豆素进样量在 0.133 5 μg～4.272 μg范围内，与峰面积值线性关系良好。

6，7-二甲氧基香豆素：A=23.688C+0.070 7，r=0.999 6；

5，7-二甲氧基香豆素：A=71.803C+2.206 8，r=0.999 9。

2.1.5 精密度试验

精密量取混合对照品溶液（每1 mL含6，7-二甲氧基香豆素 0.01144mg，5，7-二甲氧基香豆素 0.1068mg）10 μL，重复进样6次，测定两香豆素峰面积值。结果5，7-二甲氧基香豆素与6，7-二甲氧基香豆素RSD分别为0.74%、1.48%，均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验

取同一批样品佛手1#，照2.1.2项下方法制备6份供试品溶液，依次进样10 μL，测定两香豆素峰面积值并计算含量。结果5，7-二甲氧基香豆素与6，7-二甲氧基香豆素RSD分别为2.57%、2.72%，均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置，分别在 0、1、2、4、8、10、24 h 进样 10 μL，测定两香豆素的峰面积值。结果5，7-二甲氧基香豆素与6，7-二甲氧基香豆素RSD分别2.19%、2.89%，均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 加样回收试验

精密称取已知含量的佛手样品1#（分别含5，7-二甲氧基香豆素及6，7-二甲氧基香豆素0.092%、0.011%）9份，每份约0.5 g，分为三组，每组分别精密添加5，7-二甲氧基香豆素贮备液（0.534 mg/mL）0.7、0.85、1 mL，以及6，7-二甲氧基香豆素对照品储备液（0.0572mg/mL）1.6、2、2.4 mL，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，照2.1.1项下条件进行测定，并以下式计算回收率。试验结果表明，本法具有良好的回收率。结果见表2和表3。

表2 样品中5，7-二甲氧基香豆素回收率试验测定结果（n=9）Table 2 Recoveries of 5，7-dimethoxycoumarin in samples（n=9）

表3 样品中6，7-二甲氧基香豆素回收率试验测定结果（n=9）Table 3 Recoveries of 6，7-dimethoxycoumarin in samples（n=9）

2.1.9 含量测定

取10批合江佛手及其它产地佛手样品，照2.1.2项下制备供试品溶液。分别精密量取混合对照品溶液和供试品溶液10 μL，照2.1.1项下色谱条件测定，结果见表4。

表4 含量测定结果（n=2）Table 4 Content determination（n=2）

续表4 含量测定结果（n=2）Continue table 4 Content determination（n=2）

2.2 合江佛手HPLC指纹图谱研究

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Besil C18-B（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：A-乙腈，B-水，梯度洗脱条件：0～20 min，B（85%～30%），20 min～21 min，B（30%～10%），21 min～30 min，B（10%）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：326 nm；柱温：30℃。在选定色谱条件下，佛手中5，7-二甲氧基香豆素峰与其前后色谱峰的分离度大于1.5，理论板数大于4 000。

2.2.2 供试品溶液的制备

按照2.1.2项下方法制备供试品溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备

精密量取5，7-二甲氧基香豆素对照品储备液1 mL，置5 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得（每1 mL含5，7-二甲氧基香豆素0.010 68 mg）。

2.2.4 精密度试验

取佛手1#制成6份供试品溶液，照2.2.1项下条件连续进样6次，测得其共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验

取佛手1#样品制成6份供试品溶液，依次进样10 μL，测得各共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3%，表明此方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验

取佛手1#供试品溶液在室温下依次放置0、1、2、4、8、10、24 h 后进样 10 μL，照 2.2.1 项下条件进行测定，测得各共有峰的相对保留时间及相对峰面积均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 合江佛手指纹图谱的建立

将10批合江佛手（1#～10#）指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本），选择S10为参照图谱，时间窗宽度为0.1，以5，7-二甲氧基香豆素峰为参照（S）进行多点校正，并生成合江佛手药材原料指纹对照图谱。见图2、图3。

图2 5，7-二甲氧基香豆素对照品（A）及10批合江佛手原料（B）指纹图谱Fig.2 Fingerprint of reference substance（A）and 10 batches of FCS from Hejiang（B）

图3 合江佛手药材原料对照指纹图谱Fig.3 Reference fingerprint of FCS from Hejiang

2.2.8 共有峰的标定

采用相对保留时间标定共有峰。据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》规定：单峰面积占总峰面积小于10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。10批合江佛手指纹图谱中除5，7-二甲氧基香豆素参照峰外，其余峰面积均较小，不足总峰面积的10%，故仅标定共有峰的相对保留时间。将合江佛手原料的指纹图谱进行匹配后，得12个共有峰，以5，7-二甲氧基香豆素色谱峰（S峰）的保留时间为1，计算各共有峰的相对保留时间。见表5。

表5 各共有峰相对保留时间Table 5 Relative retention time of common peaks

2.2.9 相似度计算

将10批合江佛手色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）进行自动匹配，生成对照图谱，系统将每批原料与对照图谱进行相似度计算。另依次导入其余产地佛手指纹图谱，以合江佛手原料对照指纹图谱为参照图谱，计算其余产地佛手与其的相似度。结果见表6、表7。

表6 合江佛手相似度Table 6 Similarity results of FCS from Hejiang

表7 不同产地佛手与合江佛手相似度Table 7 Similarity results of FCS in different areas

3 讨论

已有的研究对广佛手，金佛手的报道较多，从成分分析、含量测定到指纹图谱均有涉及[14-18]，而川佛手研究相对较少，合江佛手的质量标准及指纹图谱研究目前还未见报道。中药指纹图谱具有整体性与模糊性的特点，本文采用HPLC法，将含量测定与指纹图谱两种分析方法相结合，即定量与定性的结合，能更全面地评价合江佛手，为其栽培和质量控制提供可靠依据。

3.1 含量测定结果分析

佛手中香豆素的主要成分为5，7-二甲氧基香豆素[16]，故选择其作为含量测定的对照品和指纹图谱的S峰。10批合江佛手的含量测定结果表明，5，7-二甲氧基香豆素的含量在0.059%～0.093%之间，变动幅度不大，可以作为佛手的含量测定指标，而6，7-二甲氧基香豆素含量在0%～0.006 4%之间，含量太低，变动较大，可为佛手质量提供参考，但不宜作为质控指标。各产地5，7-二甲氧基香豆素的含量有较明显的差异，合江产地含量较高，云南产地含量较低，6，7-二甲氧基香豆素因变动较大看不出明显差异。

3.2 指纹图谱相似度结果分析

10批合江佛手原料与对照图谱的相似度均在0.9以上，说明各批样品之间差异不明显，质量较稳定。各产地佛手与合江佛手间有显著的差异，其中浙佛手与之相似度最低，为0.623～0.690；两川产佛手（沐川、石棉）及广佛手与合江佛手相似度相对较高，表明建立的指纹图谱具有一定的代表性与实用性。

3.3 检测波长的选择

以5，7-二甲氧基香豆素，6，7-二甲氧基香豆素进样，采用二极管阵列检测器扫描，选择了205、326、350 m 3个波长测定，结果在326 nm波长下峰形和分离度较好，故检测波长选择326 nm。

3.4 流动相的选择

曾考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水等体系，经反复优化调整后采用梯度洗脱条件，乙腈-水作为流动相的色谱图分离效果最佳。

3.5 供试品的制备

试验曾考察了不同浓度甲醇（25%、50%、75%、100%）的提取效果，在提取方式方面比较了超声、回流提取及氯仿萃取等，最终发现以75%甲醇超声提取两次，每次30 min的样品溶液峰面积较高且峰形较好。试验还发现浸泡时间对提取率几无影响。