不同处理方式对花生蛋白致敏性的影响

王闽佳，丁岩汀，陈嘉惠，邓志瑞，陈沁

（上海大学生命科学学院，上海200444）

过敏反应是指易过敏体质人群接触到周围环境中一些对健康体质无影响或影响微弱的过敏原因子，引起一系列严重的免疫反应和超敏反应的现象，如粉尘过敏和食物过敏。食物过敏是一个重要的公共健康卫生问题，世界8%人口存在食物过敏[1]。其中，花生是联合国粮食及农业组织（food and agriculture organization of the united nations，FAO）报道过的八大类过敏食物中最主要的过敏原之一[2]。因此，了解最新的花生过敏研究进展，探索花生加工方式与致敏性的关系，对于找到无致敏性的花生加工工艺，提高花生类食品的安全性至关重要。

不同加工方式会影响食物中过敏原的致敏性，伴随花生加工方式的发展，人们日益喜欢食用花生，花生过敏则成为日趋严重的全球性食品安全问题[3]。本文回顾了过去传统热处理和新型非热处理加工工艺对花生致敏性影响的研究进展，对比了经过不同处理后花生蛋白结构和致敏性的变化，为加工致敏性低或无致敏性的花生制品提供参考。

1 花生过敏的研究进展

1.1 花生过敏原

过敏原是引起过敏反应即免疫球蛋白应急反应的抗原，自然界中最主要过敏原包括花粉和食物。目前，世界卫生组织-国际免疫学联合会（WHO-IUIS）收录的花生过敏原共有17种类型，分别被命名为Ara h 1-17[4]（见表1）。值得注意的是，Chapman等[5]报道WHO/IUIS过敏原命名小组委员会没有根据其重要性而对花生过敏原进行分级。但Jayasena等[6]的试验数据显示，Ara h 1～3和Ara h 6为主要的花生过敏原。食物过敏原属于一组特定的蛋白质超家族，分为cupin超家族（包括豌豆球蛋白和豆球蛋白）、醇溶蛋白超家族（包括2S白蛋白、非特异性脂质转移蛋白、α-淀粉酶和一些蛋白酶抑制剂）和植物防御蛋白家族（包括致病相关蛋白、蛋白酶和蛋白酶抑制剂）。

1.2 花生过敏危害

过敏反应症状和体征包括：气道收缩、喉咙肿胀致使的呼吸困难、皮肤瘙痒起皮疹、头晕或意识丧失等。据Radlovic等[7]调查发现，由食物引起的过敏约占过敏反应的33%，而25%的食物过敏致死病例是由花生引起的。伴随食品加工方式的多样化，在花生口味增多的同时，各国花生过敏发病率也相应地增加。Fenton等[8-9]统计数据显示，在中国、英国、美国、加拿大、以色列的花生过敏患病率分别达到了0.4%、1.7%、1.4%、1.9%和0.2%。西方国家的花生过敏病例远多于发展中国家，1%～3%的西方儿童深受花生过敏的危害。花生过敏的患者食用花生后，短时间内出现流鼻涕、口腔和喉咙周围发痒或刺痛、恶心呕吐、气短或喘息等症状，对人体的各种器官如口腔、消化道、心血管和皮肤等产生巨大影响。同时，可能出现荨麻疹、腹泻、哮喘等多种临床症状，严重时表现为过敏性休克甚至危及生命[10]。

表1 花生中17种过敏原的基本性质Table 1 The basic properties of 17 peanut allergens

1.3 花生过敏的机理

食物过敏主要有4种类型：速发型过敏反应（I型）、细胞毒性型过敏反应（II型）、免疫复合物型过敏反应（III型）和迟发型过敏反应（IV型）。大多数花生过敏反应是IgE介导的I型过敏反应。花生的致敏性蛋白与特异性IgE结合引发I型过敏反应分为3个阶段：免疫应答的致敏阶段、激发阶段和效应阶段。

Guedes等[11]认为在致敏阶段，人体初次接触花生过敏原，过敏蛋白被胃肠道黏膜表面上特异的上皮细胞吸收，并转移至抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APC），经过加工转变成细胞表面的肽片段。然后再通过主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）和T细胞受体的相互作用，将肽段呈递给Th细胞，促使Th2细胞合成并活化。据Kobayashi等[12]报道，此时Th2细胞分泌大量的IL-4和IL-13，二者刺激B细胞在致敏阶段合成对花生特异的IgE抗体。

健康体质的人群在首次摄入花生后会产生免疫耐受，不会引起花生过敏，而易过敏人群的免疫能力较差，当他们再次摄入花生过敏蛋白时即为激发阶段，此时体内的花生特异性IgE抗体会与其发生反应。IgE抗体主要通过附着在高亲和力IgE受体（FcεRI）表面，结合嗜碱性粒细胞和肥大细胞，导致细胞不稳定而进入下一阶段，即效应阶段。

Turcanu等[13]研究表明，在效应阶段，过敏原与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的花生特异性IgE抗体交联，促使这两种细胞发生脱颗粒。当肥大细胞受到破坏变形且破裂后，会释放出过敏介质，包括组胺、前列腺素、白三烯和血小板活化因子等各种炎性介质。这些炎性介质作用于不同部位，引起不同症状的过敏反应，如毛细血管舒张、平滑肌骤缩等过敏症状，进一步导致呼吸道、消化道和皮肤表皮的过敏反应，甚至引起全身性免疫应答。此外，在局部产生的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-5和趋化因子会导致嗜酸性粒细胞的激活和聚集，从而释放颗粒中的内容物质，引起人体的组织损伤并刺激炎症的发生。花生过敏过程可概括如图1。

图1 花生过敏过程示意图Fig.1 Allergic reaction to peanut

2 不同处理方式对花生蛋白致敏性的影响

不同处理方式如通过改变花生过敏原的分子结构，或通过与添加的其他成分（例如水、油或糖）的作用可以改变花生的致敏性。花生加工方法可分为两种类型：常规热处理（包括烘烤、水煮、油炸等）和非热处理（包括高压处理、辐射处理、酶法处理）[14]。热处理可以改变花生蛋白的物理化学性质，并且可以在处理时通过设置不同时间和温度来不同程度地改变蛋白质结构，从而改变花生过敏原的致敏性。与传统热处理技术相比，非热处理具有成本低、杀菌保鲜和保质期长等优点。同时，非热处理能降解花生中的大分子物质，提高花生的消化率，减少花生致敏性。

2.1 热处理对花生蛋白致敏性的影响

2.1.1 烘烤处理与美拉德反应

Cabanillas等[15]发现烘烤后花生蛋白的致敏性增强，其致敏性远高于生花生。这主要因为烘烤过程中极高温度或长时间的烘烤处理引发了美拉德反应，产生新的结构不同的复合物，提高了花生过敏原的耐热性，致使花生致敏性增强。

2.1.1.1 美拉德反应对蛋白质结构的影响

未经处理的花生蛋白通常折叠成一个特定的、紧密的三维结构，由一级结构（氨基酸序列）、二级结构（α-螺旋和β-折叠）和三级结构决定。经烘烤处理，特别是美拉德反应发生后，花生蛋白在其结构水平会发生明显的重排。当加热温度达到55℃时，花生蛋白的α-螺旋和β-折叠开始发生微小变化，在80℃时花生蛋白的二级和三级结构完全改变，二硫键几乎断裂[16]。Apostolovic等[17]发现由美拉德反应引起的蛋白质构象变化会掩蔽原有的抗体结合表位，但会产生致敏性更强的新结构，并因此促进IgE介导的过敏反应。Oliveira等[18]认为因美拉德反应而造成的蛋白质变性、不可逆的分子间相互作用等变化会导致蛋白质凝聚后发生交联反应，从而增强花生蛋白致敏性。这些美拉德反应诱导的花生蛋白构象变化可能进一步影响肠上皮对花生蛋白的消化和吸收以及对免疫细胞的识别。不同糖基化反应条件如加热时间、温度、pH值、培养基的离子强度、糖基化时还原糖的种类和浓度，都有可能改变美拉德反应对花生过敏原致敏性的影响[19]。

2.1.1.2 美拉德反应对抗原呈递细胞受体的作用

Stasio等[20]的研究发现，经美拉德反应修饰的蛋白被抗原呈递细胞（APC）识别和摄取能力增强，并呈递给T细胞。一些美拉德反应产物可以作为树突状细胞（dendritic cells，DCs）的激活剂，靶向作用于晚期糖基化终末产物（advanced glycationend products，AGE）受体（the receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）。Bastos等[21]最近的研究表明，花生蛋白在130℃干热处理时会与RAGE相互作用并形成团聚体，其结合强度和成团聚体的数量与加热时间形成呈正相关。AGE与RAGE相互作用会导致一个转录因子蛋白家族（NF-κB）活化，促进免疫细胞中RAGE表达上调和细胞信号传导，激活APC并进而促进细胞氧化和炎症发生，最终增强花生蛋白致敏性。Lee等[22]发现了相反的结果，美拉德反应修饰的蛋白不能刺激RAGE表达人体细胞系中的炎症信号途径。RAGE在致敏过程中是否激活APC的问题上，存在相互矛盾的结论，目前多数人认为Bastos等的观点更为准确。

2.1.1.3 美拉德反应对Th1/Th2型反应平衡的影响

Suseno等[23]认为，美拉德反应能促进花生蛋白形成富含β-折叠的纤维状结构，并与RAGE和CD36高亲和力结合。此外，美拉德反应和蛋白质交联都可以促进AGE与抗原呈递细胞上的受体结合，修饰T细胞的免疫原性，从而增强蛋白质的致敏性。Heilmann等[24]发现，与天然的鸡卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）相比，AGE修饰的OVA能更有效地被髓样树突状细胞（myeloid dendritic cell，mDCs）摄取，并增强特异性鸡卵清蛋白CD4+T细胞的活性。共同培养CD4+T细胞和载有AGE-OVA的成熟DC细胞，会诱导产生大量的Th2型细胞因子。而载有OVA的DC细胞则诱导Th1型细胞或调节性细胞因子的表达[25]。此外，Bernard等[26]对烘烤花生蛋白的研究也证实了AGE通过RAGE和CD36靶向作用于APC的能力，他们认为与常规的DC细胞相比，通过联合AGE受体可以增强APC的靶向和递呈作用，这可能与烘烤花生蛋白致敏性增强有关。此外，与被生花生蛋白提取物致敏的小鼠相比，用烘烤花生蛋白提取物致敏的小鼠，肠系膜淋巴结细胞分泌了更多的IL-4、IL-5和IL-13，表明T细胞应答倾向于Th2型。用烘烤花生蛋白致敏的小鼠对生花生抗原的高反应性表明，烘烤花生蛋白对花生抗原致敏的启动机制具有重要影响[27]，烘烤处理提高了小鼠对花生蛋白的敏感度。因此，美拉德反应具有引发的花生蛋白结构变化、增强AGE的免疫原性和激发异源性CD4+T细胞向Th2细胞转变的能力。

2.1.2 水煮处理

沸腾水煮处理是比较常用的花生加工方式，会引起部分花生蛋白聚集而不溶于水，抑制或减少美拉德反应对花生致敏性过敏原的提升作用，从而降低花生致敏性。Vissers等[28]发现在110℃水煮加热时，花生过敏原Ara h 2，Ara h 6大量变性、水解和聚集，损失部分二级结构，而从烘烤花生中提取的Ara h 2、Ara h 6仍保留天然构象。Rao等和Turner等[29-30]的试验数据表明，水煮还会造成花生蛋白损失，尤其是Ara h 2，Ara h 6和Ara h 7。这也是水煮花生致敏性低于烘烤花生的原因之一。张文举等[31]认为花生经水煮处理后过敏原与IgE的结合能力降低一半，不是由于花生过敏原结构改变造成的，而是因为部分过敏原如Ara h 1和Ara h 2等溶入水中，尤其是一些10 kDa～16 kDa的低分子量蛋白质和肽片断，从而降低了花生的致敏性。Tao等[32]表明，通过加长沸腾时间，可以引起花生过敏原分解和表位改变，导致花生致敏性逐渐降低。虽然分别从生花生、沸腾2 h和沸腾12 h后的花生中提取的蛋白对刺激T细胞活化和增殖的能力相同，但沸腾2 h，花生的IgE结合能力只有原来1/8，沸腾12 h则仅有1/19。这些结果都表明，水煮处理能够降低的花生的致敏性，通过2 h以上的水煮处理是获得低致敏花生制品的有效手段。

2.1.3 油炸处理

花生处理除了烘烤、水煮外，油炸也是主要的食品加工方式之一。朱青青等[31]用紫外光谱分析热处理对Ara h 2三级结构的影响时发现，在280 nm处的Ara h 2的吸光度值增加，油炸处理后的Ara h 2增加最显著，说明油炸处理会导致过敏原大量变性，严重破坏蛋白的三级结构。Comstock等[33]发现经过油炸处理后，大部分Ara h 1和Ara h 2的物理结构和化学性质会发生重大变化，并难溶于水，进而降低花生致敏性。经过油炸处理后，Ara h 1单体和三聚体的含量比烘烤花生低，与IgE的结合能力也因此下降。虽然Ara h 2、Ara h 3含量不变，但与IgE的结合能力下降。西方国家花生过敏率远高于中国，主要是因为花生处理方式不同，中国人喜欢食用水煮或油炸花生，而西方国家更喜爱食用烘烤花生及或含有烘烤花生成份的食品。

2.2 非热处理对花生过敏蛋白致敏性的影响

2.2.1 超高压微射流处理

超高压微射流处理是食品加工中的新型技术，在不影响食品色泽、风味等前提下达到灭菌效果，未来可能替代某些食品的传统热处理技术。超高压微射流技术通过压力增大花生细胞壁和细胞膜之间的通透性，使过敏原溶入细胞液中而失活，从而降低花生蛋白的致敏性。Long等[34]证明超高压微射流处理可以引起过敏原的二级结构发生变化，花生蛋白失去部分α-螺旋结构和小部分α-螺旋转化为β-折叠。与此相反，Somkuti等[35]认为高压没有导致花生蛋白出现显著的不可逆的结构变化，而是使二硫键转化成巯基，这种转变改变花生蛋白二级和三级结构，进而降低花生致敏性。

2.2.2 辐射处理

食品辐射是一种将食物暴露于高能电子或电磁波（X、γ射线或紫外线）的电离辐射处理技术。食品辐射主要用于食物保鲜，也可作为一种改变食品成分及特性的技术。在辐射处理过程中，花生过敏原的构象和致敏性会发生明显变化，并且变化程度取决于辐射的剂量。辐射剂量对二级结构和致敏性有重要影响，而对花生蛋白三级结构影响不大。Luo等[36]研究发现，辐射处理后的花生，花生过敏蛋白的α-螺旋含量明显下降，并且过敏原与IgG的结合能力也下降。随着辐射剂量从1 kGy增加到5 kGy，过敏蛋白逐渐聚集，最后形成不溶性聚集体。这表明辐射剂量越大，构象表位和致敏性下降越明显。事实上，低辐射剂量下的某些花生成分可以阻止花生蛋白致敏性降低，但是用高剂量处理时，这种保护功能不再存在。Camargo等[37]用经过γ辐射处理后的花生提取物对小鼠进行灌胃处理，并建立了致敏小鼠模型。他们发现经10 kGy辐射处理的花生蛋白提取物显著降低了细胞因子IL-4（与Th2免疫应答相关）的分泌，并增加了细胞因子IFN-γ和IL-10的产生，表明辐射处理可以降低花生蛋白的致敏性。因此，在安全范围内的高剂量辐射可能是减少或消除花生过敏原的有效方法。通过锻炼性食用辐射处理过的致敏性小的花生，有助于花生过敏患者的免疫治疗。

2.2.3 酶法处理

该生物处理方法与辐射处理相比，具有特异性强、毒性小及效率高等优点。目前，在食品加工处理方面，酶法处理与水解处理的组合虽然有可能降低或破坏食物的部分营养价值，但可以提高食物中蛋白含量，并且可以降低食物致敏的风险。近年来，酶法处理被广泛应用于花生蛋白致敏性的研究，其主要工作机制是通过酶的作用先将花生蛋白水解为小肽段，破坏蛋白结构，再研究水解作用对抗原与特异性IgE结合能力的影响。王可等[38]的研究结果表明，不同的蛋白酶处理对过敏原致敏性的影响不完全相同。

2.2.3.1 风味蛋白酶和碱性蛋白酶处理

Zheng等[39]的研究表明，风味蛋白酶（alcalase）和碱性蛋白酶（flavorzyme）是水解脱脂花生蛋白粉（defatted peanut flour，DPF）和花生分离蛋白（peanut protein isolate，PPI）最有效的蛋白酶。Shi等[40]的试验结果表明，与生花生相比，经过风味蛋白酶和碱性蛋白酶处理后，虽然花生蛋白与特异性IgE的结合能力有所降低，蛋白酶水解后的产物仍具有与IgE结合的能力。无论使用何种蛋白酶进行处理，IgE的活性位点均不被酶解，他认为风味蛋白酶和碱性蛋白酶处理没有改变花生蛋白的致敏性。Mikiashvili等[41]的免疫印迹和ELISA分析结果表明，烘烤花生蛋白在风味蛋白酶处理后，Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3花生蛋白水平均显著下降，产生的肽段可以修饰并屏蔽IgE上的抗原结合位点致使IgE活性降低。因此，风味蛋白酶可以作为过敏反应的天然抑制剂来降低花生的致敏作用。当用碱性蛋白酶处理时，Ara h 1，Ara h 3在处理300 min后仍然大量存在，IgE活性反而上升。虽然Shi等与Mikiashvili等的观点相反，但更多人倾向于上述两种酶对花生致敏性无影响的观点，并且Wu等的试验证实了Shi等的观点[42]。

2.2.3.2 双孢蘑菇中酪氨酸酶和里氏木霉酪氨酸酶处理

Zeeb等[43]的研究结果表明，双孢蘑菇中酪氨酸酶和里氏木霉酪氨酸酶与食品的蛋白交联可以用于食品加工处理。酶蛋白交联会增加蛋白分子量，改变蛋白三维结构及表面电荷，还可以改变食物过敏原的生物学特性，包括溶解性、配体结合能力、IgE结合能力和蛋白致敏性。尽管这两种酶处理后，花生蛋白可以维持IgE结合表位和抗原与IgE的结合能力，但双孢蘑菇中酪氨酸酶或里氏木霉酪氨酸酶与花生蛋白的交联促进了花生蛋白的聚集，并且双孢蘑菇的酪氨酸酶处理比里氏木霉的酪氨酸酶处理更容易使花生蛋白沉降[44]。因此，通过酶促的交联作用也是降低花生致敏性的有效方式。

3 展望

花生过敏反应具有全球性、长期性，且发病率不断上升，是造成过敏患者死亡的主要原因之一，但发现迄今为止还没有研发出一种精确高效的花生脱敏加工方式，花生的致敏性限制了花生在食品行业中的使用。因此，综合研究上述加工方式对花生蛋白致敏性的影响，是今后研究花生过敏的一个重要方向。

在各种加工方式中，烘烤处理对花生致敏性的影响最大，而美拉德反应又是烘烤处理中提高花生致敏性的关键因素，反应诱导的花生蛋白是否会影响肠上皮对花生蛋白的消化和吸收，以及对免疫细胞的作用我们不得而知。我们想了解美拉德反应修饰的花生过敏原在向T细胞呈递过程中，如何促进T细胞分泌出更多含有IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子的Th2细胞，又怎样促使产生IgE抗体从而发生花生过敏反应。并且现在尚不清楚烘烤温度和时间对美拉德反应程度的影响。综上所述，我们需要更好地研究美拉德反应在花生过敏机制中的作用，以及对花生过敏症状的影响。因此从美拉德反应层面上，探讨烘烤温度和时间对花生过敏原的影响应成为重点内容。这将有助于提高对花生过敏的诊断，并通过控制美拉德反应程度来优化花生加工方式。我们的研究可以从过敏反应体系入手，观察过敏原构象的改变，通过血清学筛选、模拟体外细胞免疫学模型及动物模型，构建多级评价结构模式，深入探讨致敏反应中炎性细胞的变化情况与花生致敏蛋白构象间的关系，深层次揭示美拉德反应对花生蛋白致敏性的影响，可以为降低花生蛋白致敏性提供理论依据。