响应面优化提取龙牙楤木中总黄酮的工艺研究

徐洪宇，蒯宜蕴，赵烊，臧梁，苏航，任重远

（吉林化工学院生物与食品工程学院，吉林吉林132022）

龙牙楤木[Aralia elata（Miq.）Seem.]，又名刺老芽，系五加科楤木属。其嫩茎叶常作山野菜食用，风味清香独特，味美可口，营养丰富，富含人体所需要的16种以上营养元素以及多种氨基酸[1-2]。研究表明龙牙楤木水提物具有可预防白内障的功效[3]。近年来对龙牙楤木中皂苷类成分研究较为深入，迄今，100余种皂苷已从龙牙楤木各部位被分离鉴定[4-6]。姚丽琴等[7]对比Plackett-Burman设计联用CCD效应面法和正交试验设计，优化龙牙楤木药材中皂苷元齐墩果酸的水解工艺，在此2种方法的最佳工艺下，最终所得齐墩果酸质量相差不大。吴舜等[8]通过Box-Behnken试验设计和响应面分析，优化龙牙楤木芽多糖提取工艺参数，优化条件下龙牙楤木芽多糖平均提取率为5.87%。

生物黄酮是一种天然活性成分，因其降血糖、降血压等功效日益受到人们的关注[9]。具有生物黄酮物质的保健品具有活性高、见效快等特点，深受现代追求“绿色健康”理念人群的喜爱，因此近年来有关植物中天然产物的活性成分的相关研究较多[10]。龙牙楤木作为传统医药中的药用植物，其中的活性成分可对中枢神经系统、生殖系统、免疫系统、呼吸系统、胃肠系统等运转发挥作用；在代谢综合症和血液凝固中能够降血脂和抗糖尿病[11]。因此本文以龙牙楤木嫩芽为试验材料，以总黄酮提取率为指标，优化其提取工艺参数，以期为龙牙楤木总黄酮的开发研究提供参考。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

龙牙楤木嫩芽：六月中旬采自吉林长春，45℃烘干，粉碎过80目筛，备用。

芦丁对照品：上海士锋科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美国Sigma公司；无水乙醇、无水氯化铝、甲醇、乙酸钾：均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

FW100型高速万能粉碎机、DK-98-IIA型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；KQ3200DE型数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FA1004A型电子天平：上海精天电子仪器有限公司；80-2型电动离心机：金坛市华城开元实验仪厂；722S可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 工艺流程

龙牙楤木嫩芽→干燥→粉碎过筛→乙醇溶液提取→恒温水浴→离心过滤→取上清液→测定吸光度→计算总黄酮提取率

2.2 试验设计

分析乙醇浓度（%）、提取温度（℃）、提取时间（min）、料液比（g/mL）4个单因素对龙牙楤木总黄酮提取率影响的试验结果，确定其中的3个影响因素并建立响应面试验模型。

2.3 绘制芦丁标准曲线

采用AlCl3法测定龙牙楤木总黄酮的含量，配制不同浓度的芦丁溶液为对照品，于420 nm处测定吸光值。标准曲线以芦丁质量浓度x（mg/mL）为横坐标，吸光度y为纵坐标，得到标准曲线方程y=0.563 4x+0.073 2（R2=0.999 2）。

2.4 总黄酮的提取及提取率测定

准确称取0.500 g过筛后龙牙楤木粉于10 mL离心管中，以不同浓度乙醇作为提取剂，混匀液料后置于恒温水浴锅中，以不同温度进行水浴浸提，完成后将浸提液离心过滤，滤液置于50 mL容量瓶中，测定其吸光值后参照芦丁标准曲线测定其总黄酮含量，由此计算龙牙楤木总黄酮提取率率。

2.5 单因素试验提取总黄酮[12-13]

不同乙醇浓度：取龙牙楤木粉样品9份，每份样品0.500 g，放入试管中，依次加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液10 mL，在60℃条件下，水浴提取30 min，离心过滤，收集溶液，提取液定容，按2.4节方法测定提取率。

不同提取温度：取龙牙楤木叶粉样品5份，每份样品0.500 g，放入试管中，加入浓度为70%的乙醇10 mL，分别在 40、50、60、70、80 ℃条件下，水浴提取 30 min，离心过滤，收集溶液，提取液定容，测定提取率。

不同料液比：取龙牙楤木粉样品6份，每份样品0.500 g，放入试管中，依次加入浓度为70%的乙醇2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 mL，在 60 ℃条件下回流提取30 min，离心，过滤，收集溶液，提取液定容，测定提取率。

不同提取时间：取龙牙楤木叶粉样品5份，每份样品0.333g，放入试管中，加入70%的乙醇10mL，在70℃水浴条件下提取 20、30、40、50、60 min，离心，过滤，收集溶液，提取液定容，测定提取率。

2.6 响应面试验优化提取工艺

参考文献方法[14-15]，以乙醇浓度（A，%）、提取温度（B，℃）、提取时间（C，min）3个单因素为自变量，龙牙楤木总黄酮提取率Y（%）为响应值设计三因素三水平响应面分析试验。此因素水平编码表见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平及编码水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

2.7 龙牙楤木总黄酮对DPPH自由基清除力测定

0.1 mmol/L DPPH自由基以无水乙醇溶解配制。以抗坏血酸作对照。吸取1.0 mL不同浓度待测样品于试管中，加入3.0 mL DPPH反应液，加入4 mL无水乙醇，混匀，避光反应30 min，在波长为517 nm处测吸光值，以无水乙醇做空白，测定空白样吸光值。龙牙楤木总黄酮对DPPH自由基清除率按下式计算：

式中：A0为空白样品与反应液反应后的A517nm值；Ai为不同浓度待测样品与反应液反应后的A517nm值。

2.8 数据处理方法

试验均进行3次重复，结果表示为3次结果平均值，试验数据处理运用Origin 2016、Design-Expert 8.0.6软件。

3 结果与分析

3.1 龙牙楤木总黄酮提取单因素试验结果分析

龙牙楤木总黄酮提取单因素试验结果分析见图1。

图1 乙醇体积分数、提取温度、料液比、提取时间对黄酮得率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration，extraction temperature，liquid to solid ratio and extraction time on extraction yield of flavonoids

总黄酮提取率随着乙醇浓度的增大先上升后下降，70%时提取率达到最大（图1a）。根据“相似相溶”原理，不同浓度乙醇对物质有不同的溶解力。当乙醇浓度较低时，提取液中的水含量高，使得水溶性的糖类物质析出较多；当乙醇浓度较高时，龙牙楤木中醇溶性物质溶出量增大[13]，单位体积提取剂给予龙牙楤木总黄酮的空间减小，导致提取率降低。综合考虑原料和试剂消耗等因素，选取乙醇浓度为60%、70%、80%3个水平进行响应面试验。

提取温度对于龙牙楤木总黄酮提取率有一定影响，总黄酮提取率随温度的升高而升高，70℃时最大，后开始呈下降趋势（图1b）。分析可能是由于适当升温有利于黄酮类物质的溶出、扩散[16]；但当温度过高时，一方面乙醇提取剂开始挥发，导致提取剂浓度降低，另一方面温度过高会造成黄酮类物质结构破坏，致使黄酮提取率降低。综合考虑原料和能源消耗等因素，选取温度为60、70、80℃3个水平进行响应面试验。

在不同料液比条件下，龙牙楤木总黄酮提取率随料液比呈先增加后降低（图1c）。当料液比为1∶30（g/mL），龙牙楤木总黄酮提取率最高；当料液比超过1∶30（g/mL）时，总黄酮提取率开始降低，分析可能原因是由于单位体积提取剂内黄酮含量降低，被分散的黄酮容易发生变性分解。综合考虑原料和试剂消耗等因素，选定料液比1∶30（g/mL）进行后续试验。

龙牙楤木黄酮提取率随着提取时间的增加而增加，在30 min提取率达到最高后开始降低（图1d）。延长提取时间使得黄酮充分溶出，提取率升高，但提取时间继续增加，由于黄酮含量为一定值，大部分黄酮已基本溶出后，黄酮含量不再升高[14-16]；若提取时间过长，容易造成黄酮的缓慢分解。综合原料消耗和时长等因素，选取提取时间20、30、40 min 3个水平进行响应面试验。

3.2 响应面试验优化龙牙楤木总黄酮提取工艺

Box-Behnken设计响应面优化试验的结果如表2。

表2 龙牙楤木总黄酮提取Box-Behnken试验方案与结果Table 2 Extraction of Box-Behnken test scheme and result of Aralia elata

利用Box-Behnken选项对表2数据进行多元回归拟合，获得龙牙楤木总黄酮提取率Y（%）对乙醇浓度 A（%）、提取温度 B（℃）和提取时间 C（min）的二次多项回归方程：

Y=2.20-0.024A-0.081B-0.01C-0.065AB-0.098AC-0.097BC-0.44A2-0.34B2-0.38C2

影响龙牙楤木总黄酮提取率因素的显著顺序为：B>A>C（提取温度>乙醇浓度>提取时间）。对二次回归方程进行方差分析的结果见表3。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

续表3 回归模型方差分析表Continue table 3 Analysis of variance of regression model

结果表明，该回归模型极显著（P<0.01），失拟项P=0.125 1，不显著，决定系数R2=0.997 6；此数据表明模型与数据拟合程度较高，对于优化提取龙牙楤木总黄酮是一较为合理准确的预测模型。

乙醇浓度（A），提取温度（B），提取时间（C）3个交互因子之间的交互作用对龙牙楤木总黄酮提取率的影响可由观察响应曲面的变化情况和等高线的疏密程度而知。如图2，响应曲面图呈良好的伞状，等高线呈椭圆形且分布紧密，表示两因素交互作用显著[17-18]；黄酮提取率由四周边缘向内逐渐增大，在中心位置时提取率最大。

图2 乙醇浓度、提取温度、提取时间对黄酮得率影响的响应面及等高线Fig.2 The contour and response surface of ethanol concentration，extraction temperature and extraction time influenced the yield of flavonoids

通过分析，龙牙楤木总黄酮的最佳提取条件是：乙醇浓度69.8%，提取温度68.8℃，提取时间30.0 min，总黄酮提取率的理论值为2.21%。在此最佳工艺参数下进行验证试验，平行3次，3次结果的总黄酮提取率平均值为2.20%，与预测值基本一致，相对误差为0.45%，说明此模型适用于模拟优化龙牙楤木总黄酮提取率。

3.3 龙牙楤木总黄酮抗氧化活性

龙牙楤木总黄酮对DPPH自由基的清除作用见图3。

图3 龙牙楤木总黄酮对DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activity to DPPH·of flavonoids from Araliaelata

随着浓度增加，抗坏血酸作对照，龙牙楤木总黄酮对DPPH自由基的清除率呈上升趋势。DPPH自由基清除力是抗氧化活性的重要指标[19-20]，因此龙牙楤木总黄酮对DPPH自由基具有良好的清除能力，即具有一定的抗氧化活性。

4 结论

通过单因素试验分析选出乙醇浓度、提取温度、提取时间的三因素三水平取值，利用Box-Bohnken Design原理设计试验。结果表明，3个提取因素对总黄酮提取率影响的显著顺序依次为：提取温度＞乙醇浓度＞提取时间。

通过响应面分析优化所得最佳提取参数为：乙醇浓度69.8%，提取温度68.8℃，提取时间30 min，该条件下理论总黄酮提取率为2.21%。验证试验测得总黄酮提取率为2.20%，相对误差为0.45%，说明此优化参数较为合理正确。