马齿苋多糖抑制HepG2细胞存活的作用机制

胡庆娟，牛庆川，宋皓，白书瑜，贺文杰，李玉萍

（江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌330013）

马齿苋（Portulaca oleracea L.）为药食两用的一年 生草本植物，具有神经保护[1-2]、抗菌[3]、抗糖尿病[4-5]、抗氧化[6]、抗炎[7]、抗癌[8-10]等多种功效。研究表明马齿苋中含有生物碱、黄酮、多糖、多巴胺等多种生物活性成分[11-15]。其中，马齿苋多糖（polysaccharide of Portulaca oleracea L.，POP-A）是其主要活性成分之一，具有提高免疫力、抗病毒、降糖调脂、抗癌及抗衰老等生物活性[10，16-23]。

目前对POP抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡已有少量的初步研究。Zhao Rui等[10，18]研究结果表明POP可抑制宫颈癌细胞的增殖，通过参与调控TLR4/NF-kB信号通路，触发DNA损伤，诱导细胞凋亡；崔旻等[24]研究表明POP可以抑制SMMC7721肝癌细胞，增强细胞免疫；王晓波等[25]研究发现POP可以抑制BEL-7402肝癌细胞，提高细胞免疫，具有明显的抑制肿瘤的作用；丁虹等[26]研究结果表明POP能够抑制宫颈癌细胞生长，诱导癌细胞凋亡。但对于HepG2肝癌细胞的研究还鲜见报道。

为此，本研究在课题组前期分离提取马齿苋多糖的基础上，以HepG2肝癌细胞为研究对象，采用体外培养法和四甲基偶氮唑盐[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]法检测了POP-A对HepG2肝癌细胞的抑制作用，同时采用荧光定性定量法、免疫印迹法和反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）法探讨了POP-A抑制HepG2肝癌细胞的作用机制，为POP-A抗肿瘤活性的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马齿苋多糖POP-A按照江西科技师范大学生命科学学院实验室之前的优化条件获取[27]。

改良杜氏伊格尔培养基（dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、焦碳酸二乙酯水（diethylpyrocarbonate，DEPC）：美国Gibco公司；胎牛血清（fatal bovine serun，FBS）：杭州四季青生物工程有限公司；青链霉素双抗（100×）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（1×）、四甲基偶氮唑盐（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒、Fluo-3 AM钙离子荧光探针、Beyozol试剂、ECL发光试剂盒、Western及IP细胞裂解液、山羊抗兔lgG（H+L）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、山羊抗小鼠 lgG（H+L）、抗体（p53、Bax）：碧云天生物技术有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美国 Ameresco公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸、Tris-Hcl-tween缓冲液（Tris buffered saline tween，TBST）：北京索莱宝生物科技公司；AII-in-One First-StrandcDNA试剂盒、Synthesis SuperMixfor qPCR：北京全式金生物技术有限公司；Protein Ladder：美国Ladder Thermo公司；蛋白变性5×SDS-PAGE上样缓冲液：康为世纪公司；所用化学试剂均为国产分析纯。

Hank’s 液：0.14 g CaCl2，0.4 g KCl，0.06 g KH2PO4，0.10 g MgSO4·7H2O，8.0 g NaCl，0.35 g NaHCO3，0.12 g Na2HPO4·12H2O，1.0 g D-葡萄糖，0.01 g Phenol red（酚红），10 mL FBS，溶于1 000 mL新鲜超纯水中，0.22 mm过滤，4℃保存。

细胞培养板：美国Corning公司；水机相微孔滤膜：美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

HV-85型高压灭菌锅：日本Hirayama公司；IX-71型倒置光学显微镜：日本Olympus公司；Thermo Forma Series-Ⅱ型CO2培养箱、Multiscan MK3型全自动酶标仪、Forma class-II/A2生物安全柜：美国Thermo公司；JJ500精密电子天平：美国双杰兄弟公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；PHS-29A数显酸度计：上海虹益仪器有限公司；5804R型离心机：德国Eppendorf公司；F-2700荧光分光光度计：日本Corporation公司；Vortex-Genie 2漩涡振荡器：美国Scientific公司；SZCL-4型数显智能控温磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限公司；THZ-82A型水浴恒温振荡器：江苏金坛市荣华仪器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 HepG2肝癌细胞的培养

HepG2细胞培养在DMEM培养液（10%FBS，37℃）中，当细胞生长到培养瓶底部的80%左右时进行传代培养或以下试验研究。

1.3.2 MTT法检测POP-A对HepG2肝癌细胞存活率的影响

将HepG2细胞以1×105个/mL的浓度种到96孔培养板中，37℃培养24 h后，分别加入不同浓度的POP-A处理细胞24 h或48 h，之后更换新鲜DMEM培养基，避光加入20 mL 5 mg/mL的MTT，37℃培养箱中孵育4 h后，除去全部孔的上清，将150 mL的DMSO依次加入每孔，用锡箔纸包裹培养板后，放于摇床上摇动10 min，在波长为492 nm处，使用酶标仪检测吸光度，计算并分析各组的细胞存活率，公式如下：

1.3.3 POP-A对HepG2肝癌细胞线粒体膜电位的影响

将HepG2细胞悬液以1×105个/mL的浓度种到6孔培养板中，37℃过夜培养后，分别加入1.25、2.5、5 mg/mL 3个浓度的 POP-A，再孵育24 h（37℃），吸弃上清，加PBS轻洗两次，并将残余的PBS吸净。随后加入含5 mg/mLJC-1工作液的培养基，37℃孵育60 min，吸弃上清，用PBS溶液洗涤细胞两次。每孔加入2 mL的DMEM培养液，37℃孵育30 min，在荧光显微镜下观察。

阳性对照组设置：取1 mL碳酰氰基-3-氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone ，CCCP）（10 mmol/L）加入到1 mL新鲜培养基中，使得终浓度为10 mmol/L。将含10 mmol/L CCCP的培养基加入到6孔培养板中，放于培养箱中孵育20 min。孵育完成，吸弃上清，用JC-1染色缓冲液洗涤细胞两次。每孔加入2 mL的DMEM培养液，37℃孵育30 min，在荧光显微镜下观察。

1.3.4 POP-A对HepG2肝癌细胞内钙离子的影响

将HepG2细胞悬液以1×105个/mL的浓度种到6孔板中，每孔2 mL。37℃培养过夜后，每孔分别加入1.25、2.5、5 mg/mL 3个浓度的 POP-A，再孵育 24 h（37℃）。吸弃上清，加PBS轻洗两次，并将残余的PBS吸净。加入含4 mmol/L的Fluo-3 AM的培养基（不含血清），37℃孵育20 min。之后每孔加5倍体积的Hank’s（含 1%FBS）再培养 40 min，装载完成之后，吸弃上清，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗3次，在荧光显微镜下观察。之后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液重悬细胞，用激发波长为488 nm，发射波长为526 nm的荧光分光光度计，检测细胞内钙离子的浓度。

1.3.5 POP-A对HepG2肝癌细胞中p53和Bax蛋白表达的影响

将6孔板放置于冰上，加PBS轻洗2次。取出蛋白裂解液，将苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）与裂解液按 1∶100比例（体积比）混合，每孔加入1 mL裂解液，充分吹打至细胞完全脱落，之后移置离心管中，4℃离心（12 000 r/min，10 min），取上清，即为不同组别的细胞蛋白质样品，-20℃保存备用。制备10%分离胶和5%浓缩胶，取等量蛋白上样，电泳。电泳结束后，转膜，取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，封闭 2 h，一抗孵育（一抗的稀释根据具体的说明书），4℃过夜。用TBST缓冲液洗去膜上残余一抗。二抗孵育（二抗的稀释和种类根据具体的说明书），室温平摇1 h后，用TBST缓冲液洗去膜上残余二抗；ECL检测、曝光、显影、定影[28]。

1.3.6 POP-A对HepG2肝癌细胞中p53和Bax基因表达的影响

取出6孔培养板，吸弃上清，PBS洗涤3次，每孔加入1 mL Beyozol，晃动3～5下，之后加入裂解液，充分吹打至细胞完全脱落，移置1.5mL的离心管里，静置5 min，充分裂解样品。加0.2 mL氯仿，涡轮混合15 s，静置3 min，4℃离心（12 000 r/min，15 min），取上层，加0.5 mL异丙醇，晃动混匀，静置10 min，4℃离心（12 000 r/min，10 min），吸弃上清，即得到RNA白色沉淀。加1mL75%乙醇（DEPC水配制），剧烈涡旋至沉淀完全脱离管壁，充分洗涤沉淀。4℃离心（7 500 r/min，5 min）。弃上清，用小型离心机（转速＜5 000 r/min）离心1 s，吸弃上清。待RNA略干后，加入RNA溶解液溶解，分装到200mL离心管中，-80℃保存备用。取2 mL RNA样品于微量分光光度计测定。以OD260/280表示RNA的纯度，测定值在1.8～2.0范围内，则可用于后续试验。

按顺序 5×TranscriptTM All-in-One SuperMix forq PCR（4 mL），RNase-free 水（15 mL），总 RNA/mRNA（1 mL）加入PCR管中，使总RNA充分接触混合液。轻轻混匀后，将PCR反应体系放于PCR仪内，按照42℃（10 min），42℃（5 s），4℃结束，进行逆转录反应，合成cDNA，将合成的cDNA存放于-80℃备用。

PCR所用引物序列见表1，反应体系见表2，反应条件见表3。

表1 实时荧光定量PCR的引物序列表Table 1 Table of the primer sequence in RT-PCR

表2 实时荧光定量PCR的反应体系Table 2 Reaction system of RT-PCR

续表2 实时荧光定量PCR的反应体系Continue table 2 Reaction system of RT-PCR

表3 实时荧光定量PCR的反应条件Table 3 Reaction condition of RT-PCR

1.3.7 数据统计与分析

试验结果以表示，计量资料用方差分析法分析，用t检验统计处理。P＜0.05被认为两变量之间有统计学显著性差异。

2 结果与分析

2.1 POP-A对HepG2肝癌细胞存活的抑制作用

POP-A对HepG2肝癌细胞存活率的影响见图1。

图1POP-A对HepG2肝癌细胞存活率的影响Fig.1 Effects of POP-A on the viability of HepG2 cells

由图1可知，与对照组相比，POP-A处理HepG2肝癌细胞24 h和48 h之后，显著的降低HepG2肝癌细胞的存活率，且随着POP-A浓度及处理时间（分别为24 h和48 h）的增加，HepG2肝癌细胞的存活率逐渐降低。当POP-A浓度为1.25、2.5、5 mg/mL时，可明显的降低细胞的存活率，因此，选用1.25、2.5、5 mg/mL的POP-A用于后续试验。

2.2 POP-A对HepG2肝癌细胞线粒体膜电位的影响

POP-A对HepG2肝癌细胞线粒体膜电位的影响见图2。

图2POP-A对HepG2肝癌细胞的线粒体膜电位的影响Fig.2 Effects of POP-A on mitochondrial membrane potential of HepG2 cells

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个特点[29]。JC-1线粒体荧光探针常被用于线粒体膜电位的检测，A（JC-1多聚体状态）代表线粒体膜电位升高，细胞处于正常状态；B（JC-1单体状态）代表线粒体膜电位下降，细胞处于凋亡早期。从图2可知，与对照组相比，用POP-A处理的HepG2肝癌细胞，红色荧光的细胞比例降低，绿色荧光的细胞比例增加，表明POP-A降低了细胞的线粒体膜电位，诱导了细胞的早期凋亡。

2.3 POP-A对HepG2肝癌细胞内钙离子的影响

POP-A对HepG2肝癌细胞内钙离子的影响见图3。

图3 POP-A对HepG2肝癌细胞内Ca2+浓度的影响Fig.3 Effects of POP-A on Ca2+concentration on HepG2 cells

由图3A可知，与对照组相比，POP-A组中的钙离子荧光强度增强。同时由图3B的统计结果可知，与对照组相比POP-A组中的钙离子浓度明显升高，表明POP可促进HepG2肝癌细胞内钙离子浓度的增加。

2.4 POP-A对HepG2肝癌细胞中p53和Bax蛋白表达的影响

POP-A对HepG2肝癌细胞中p53蛋白表达的影响见图4

图4POP-A对HepG2肝癌细胞p53蛋白水平表达的影响Fig.4 Effects of POP-A on the expression of p53 protein in HepG2 cells

由图4分析结果可知，与对照组相比，HepG2肝癌细胞经POP-A处理后，p53蛋白表达显著升高，且p53蛋白表达量随POP-A浓度的增大而逐渐升高。

POP-A对HepG2肝癌细胞中Bax蛋白表达的影响见图5。

图5 马齿苋多糖POP-A对HepG2肝癌细胞Bax蛋白水平表达的影响Fig.5 Effects of POP-A on expression of Bax protein in HepG2 cells

由图5结果可知，与对照组相比，HepG2肝癌细胞经POP-A处理后，Bax蛋白表达显著升高，且Bax蛋白表达量随POP-A浓度的增大而逐渐升高。

2.5 POP-A对HepG2肝癌细胞中p53和Bax基因表达的影响

POP-A对HepG2肝癌细胞中p53基因表达的影响见图6

图6POP-A对HepG2肝癌细胞p53基因表达的影响Fig.6 Effects of POP-A on expression of p53 gene in HepG2 cells

由图6结果可知，与对照组相比，HepG2肝癌细胞经POP-A处理后，p53基因相对表达量显著增加，且呈一定的浓度依赖性。

POP-A对HepG2肝癌细胞中Bax基因表达的影响见图7。

由图7结果可知，与对照组相比，HepG2肝癌细胞经POP-A处理后，Bax基因相对表达量显著增加，且基因相对表达量随POP-A浓度的增大而逐渐增加。

图7POP-A对HepG2肝癌细胞Bax基因表达的影响Fig.7 Effects of POP-A on expression of Bax gene in HepG2 cells

3 结论

采用MTT法结果显示，与对照组相比，用POP-A分别处理HepG2肝癌细胞24 h和48 h后，均能显著降低HepG2肝癌细胞的存活率，且呈一定的浓度依赖性。从结果中可知在POP-A浓度为1.25、2.5、5 mg/mL时，作用效果最为显著。

细胞凋亡是细胞死亡的方式之一，是细胞受到外界刺激时，对刺激所作出反应的一种主动性的死亡方式。研究表明，肿瘤细胞的死亡多是通过凋亡引起的，凋亡对于抑制肿瘤的发生及发展具有重要的作用，很多抗肿瘤药物也是通过引起细胞的凋亡来达到抗肿瘤的目的的[30-31]。细胞早期凋亡的重要特征之一是线粒体膜电位降低。当线粒体膜电位降低时，线粒体功能丧失，引起细胞内钙离子浓度增加，细胞发生凋亡[29]。本试验采用荧光定性及定量的方法检测了POP-A对HepG2肝癌细胞线粒体膜电位及细胞内钙离子浓度的影响。结果显示，与对照组相比，POP-A降低了HepG2肝癌细胞线粒体膜电位，提高了细胞内钙离子浓度。表明POP-A可通过降低HepG2肝癌细胞线粒体膜电位，增加细胞内钙离子浓度，导致细胞内环境紊乱，对HepG2肝癌细胞起到抑制作用，初步推断POP-A抑制HepG2肝癌细胞的作用机制与促进HepG2细胞凋亡有关。

p53基因是研究较为广泛的一种抑癌基因，与细胞的增殖、死亡以及肿瘤的产生具有密切的关系。研究表明，p53基因上调，可进一步上调下游的促凋亡基因Bax的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，进而导致细胞死亡，抑制肿瘤的产生[30]。本试验中蛋白印迹和RT-PCR结果显示，与对照组相比，POP-A显著提高了HepG2肝癌细胞中p53及Bax基因和蛋白的相对表达量，且呈一定的浓度依赖性，推测POP-A通过激活p53下游信号通路对HepG2肝癌细胞起到抑制作用，引起HepG2肝癌细胞的凋亡，导致细胞死亡。

综上可知，POP-A抑制HepG2肝癌细胞的作用机制与促进HepG2细胞凋亡有关，主要涉及降低线粒体膜电位，增加细胞内钙离子浓度，激活p53下游信号通路等。由于POP-A抑制HepG2肝癌细胞的作用机制复杂且多样，其具体作用机制仍需进一步的研究。