肝细胞肝癌中ZNF146蛋白的表达及意义

徐林芳，卞兆连，邵建国

（南通市第三人民医院，江苏226006）

中国是世界上原发性肝癌高发国家,约占全球原发性肝癌患者的55%,居我国恶性肿瘤发病率的第三位[1],其原因可能与我国乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）高感染率有关,目前肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的发病机制仍未完全阐明。HCC早期发现较为困难,而且疾病发展快、转移早、预后差、生存期短。锌指蛋白（Zinc finger protein）是诺贝尔奖获得者Klug及其同事在爪蟾转录因子ⅢA（TFⅢA）蛋白质中首先发现[2],是一种重要的转录因子。大量研究发现,锌指蛋白是哺乳动物细胞内含量最丰富的蛋白质模体,能够与各种特异性DNA结合[3]。进一步研究发现锌指蛋白与真核基因的表达调控密切相关。目前锌指蛋白和肿瘤的关系已经成为国内外关注的热点。锌指蛋白146（Zinc finger protein146,ZNFl46）是一种分子量为33 kDa蛋白,包含10个锌指结构,在肝、骨骼、心肌等组织有表达,肠癌、胰腺癌中ZNF146蛋白的表达明显增高[4]。本研究收集我院2017年1月—2017年10月行手术治疗HCC患者40例肿瘤组织及癌旁组织标本,主要阐述ZNFl46在肝细胞肝癌中的表达及其与临床病理参数之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 行手术治疗的HCC患者40例,其中男性32例,女性8例,年龄54.8±9.0岁；肝癌直径＜5 cm 21例,≥5 cm 19例；临床分期Ⅰ～Ⅱ期18例,Ⅲ～Ⅳ期22例；乙肝病毒表面抗原（HBsAg）阳性30例,阴性10例。收集患者手术切除的肿瘤组织及癌旁组织标本,新鲜组织标本-80℃保存。病理检查标本置于中性福尔马林固定后常规切片、HE染色。所有患者术后病理证实均为原发性HCC。本研究经医院伦理委员会批准,所有组织标本的采集均获得患者的知情同意。

1.2 实验试剂 引物由上海生工生物工程有限公司合成；RNAiso Plus,Takra逆转录试剂盒,荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]；ZNF146抗体（美国Abnova公司）；辣根过氧化物酶结合的二抗（上海长岛生物科技有限公司）；磷酸盐缓冲液(PBS)以及柠檬酸盐缓冲液（pH值6.0）（福州迈新生物技术开发公司）。

1.3 方法

1.3.1PCR检测：提取组织RNA并测定RNA浓度,使用逆转录试剂在Applied Biosystems GeneAmp 9700 PCR 系统（37 ℃,15 min；85 ℃,5s；4 ℃,5 min）行逆转录,获取的cDNA置于-20℃冰箱保存。使用Takra荧光定量试剂行PCR（CFX Connect Real time System）检测基因表达量。根据Power=2-△△CT计算相对表达量,对Power值进行统计学分析。引物序列：ZNF146 引物序列：Forward 5’-TTTTGAGTGTAAAGATTGCGGG-3’,Reverse5’-TCATGCTCAGTAAGGTTGGATT3’；β -actin 引 物 序 列 ：Forward 5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG3’,Reverse 5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGA-3’。

1.3.2 免疫组化检测：组织标本以10%福尔马林固定24 h,常规脱水,石蜡包埋,4 μm厚连续切片。二甲苯、乙醇等梯度脱蜡至水,PBS洗涤。3%H2O2孵育15 min,随后以柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）行微波抗原修复12 min,冷却后用非免疫羊血清室温孵育30 min以阻断内源性过氧化物酶。立即滴加抗ZNF146抗体（兔抗人,1∶150稀释）,置于湿盒中4℃冰箱过夜。次日PBS洗涤后,滴加辣根过氧化物酶结合的二抗（鼠抗兔,即用型）孵育30 min,以DAB显色约1 min,苏木精复染,封片。由病理医师根据着色强度评分,分别统计不表达（无棕色阳性颗粒）,弱阳性（+,少量棕色阳性颗粒表达）,强阳性（++,大量棕色阳性颗粒表达）。

1.4 统计学处理 采用GraphPadPrism6统计学软件进行数据分析。计量资料组间比较采用配对t检验,计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HCC肿瘤组织和癌旁组织中ZNF146的表达荧光定量PCR检测结果显示,40例HCC肿瘤组织中ZNF146 mRNA表达明显高于癌旁组织,差异有统计学意义（P＜0.05,图1A）。免疫组化检测同样显示肿瘤组织中ZNF146蛋白的表达较癌旁组织明显增高,差异有统计学意义（P＜0.05,图1B,表1）。图1见封二。

表1 HCC肿瘤组织及癌旁组织中ZNF146的表达 例

2.2 HCC肿瘤组织中ZNF146表达与临床病理参数的关系 在不同分期及不同大小肿瘤中ZNF146表达的差异有统计学意义（P＜0.05）,肿瘤直径≥5 cm、Ⅲ/Ⅳ期肿瘤患者中ZNF146表达明显增加。而在患者年龄、性别、是否有HBsAg感染的不同组别中ZNF146表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 ZNF146表达与肝癌患者临床病理参数的关系

3 讨 论

锌指蛋白是指含有结合Zn2+稳定的短的可以自我折叠形成“手指”样结构的一类蛋白质,是哺乳动物中最大的转录调控因子家族,在胚胎发育、细胞分化、细胞转化及细胞周期的调控中发挥重要功能。研究发现大多数锌指蛋白与恶性肿瘤的发生、发展密切有关[5],锌指蛋白家族中ZNF23在原发性HCC中的表达明显降低,并且与顺铂的化疗作用密切相关,顺铂可能通过上调HCC系表达ZNF23,从而促进细胞凋亡[6]。ZNF146是锌指蛋白家族的成员之一,有研究发现其在乳腺癌中的表达明显增加,并且随着细胞分化程度的降低,其表达量增加更为明显,提示ZNF146对诊断乳腺癌有一定的价值[7]。Ferbus等[8]通过免疫组化发现结肠癌组织中ZNF146的表达明显增加,而正常肠道黏膜上皮和炎症肠道黏膜上皮很少表达,提示ZNF146可能与肿瘤的发生密切相关。ZNF146在肝脏中也有表达,但与HCC发生的关系不明确。本研究结果显示,HCC肿瘤组织中ZNF146 mRNA及其蛋白的表达明显高于癌旁组织,差异有统计学意义（P＜0.05）,提示ZNF146可能参与HCC的发生和演进。

HCC的发生是一个多阶段、多因素长期暴露和累积的结果,与HBV感染导致的慢性乙型肝炎密切相关[9]。研究发现,多种锌指蛋白参与HCC的发病机制,例如ZNF165[10],ZNF233[11]等。我们进一步通过研究HCC肿瘤组织中ZNF146的表达与临床病理参数的关系,发现在肿瘤不同分期及不同大小肿瘤中ZNF146表达的差异有统计学意义（P＜0.05）,肿瘤直径≥5 cm、Ⅲ/Ⅳ期肿瘤患者中ZNF146表达明显增加,而在患者年龄、性别、是否有HBsAg感染的不同组别中ZNF146表达差异无统计学意义（P＞0.05）,提示ZNF146与肿瘤的分化及进展密切相关,ZNF146表达的异常可能是HCC发病机制的因素之一。

综上所述,本研究发现ZNF146与HCC发生发展密切相关,ZNF146有可能是HCC潜在的生物标志物之一,但具体作用的分子机制和信号通路还需要进一步通过肝癌细胞生物学功能实验和荷瘤动物实验等手段深入研究。