梵净山野生百合种质资源遗传多样性ISSR研究

2019-01-21姚琦馥

铜仁学院学报 2018年12期

关键词：梵净山条带百合

姚琦馥，王婷，邱岚

姚琦馥1，王婷2，邱岚1

（1．铜仁学院农林工程与规划学院，贵州铜仁 554300； 2．吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000 ）

ISSR；梵净山；野生百合；遗传多样性

1．引言

百合(e)是一类多年生鳞茎草本植物的总称，隶属于百合科()百合属()[1]，是世界重要的观赏花卉，具有重要的经济价值，备受人们的喜爱[2]。我国具有丰富的野生百合资源[3]，但是目前破坏比较严重，濒危种不断增多，对野生百合资源的保护举措也远远不及国外，因此有效开展我国野生百合资源的开发与保护工作已迫在眉睫[4]。

梵净山位于贵州省东北部，是武陵山脉的主峰，已被评为国家级自然保护区，同时又是联合国“人与生物圈保护区网”成员之一，其境内野生百合资源十分丰富，其中《贵州植物志》对其种类、形态、使用价值等有一定的记载[5]。近年来，我国野生植物种质资源的开发和利用越来越受到重视。遗传多样性的研究是种质资源利用的一个重要内容，一个物的遗传多样性越高，对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。目前，野生植物种质资源以开展遗传多样性研究为主要趋势[6]，而百合属植物遗传多样性的研究多集中在栽培品种上，对梵净山野生动植物保护区的野生百合遗传多样性研究尚属空白。因此，本文利用ISSR分子标记技术对梵净山5个百合野生种质材料、以及5个对照百合种质材料的亲缘关系进行研究[7-9]，对制定野生百合种质资源遗传多样性保护措施、合理开发利用百合种质资源以及指导百合新种质的创新和新品种选育具有重要意义，同时为进一步进行分子标记辅助育种、数量性状定位和构建遗传图谱奠定基础[10-11]。

2．材料与方法

2.1．材料

2.1.1．百合

本研究选用了5个梵净山野生百合种质材料，分别为梵野1号、梵野2号、梵野3号、梵野4号、梵野5号；5个对照品种如表1所示。所有百合材料均由铜仁市农科所百合基地提供。每份材料选新鲜鳞茎置于封口袋中，并立即放入预装干冰的保鲜盒中保存，用于DNA的提取。

表1 百合材料地理来源及花色

2.1.2．主要试剂

本研究所用试剂分别为dNTP、MgCl2、TaqDNA 聚合酶、10×Taq buffer、DL2000 DNA Marker等，均购自上海生工生物工程有限公司。ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第九套引物序列和日本Masumi Yamaishi等人在百合研究中所采用的3AISSR引物序列，并由华大基因公司合成。

2.2．方法

2.2.1．百合总DNA的提取

采用陈名红等[12]的CTAB法经改进提取基因组DNA，利用紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行质量和浓度的检测，稀释样品浓度至20ng/μL后分装并贮于-20℃条件下备用。

2.2.2．PCR扩增

总体积为20uL，其中含1uL模板DNA（20 ng/uL），2 uL 10×PCR Buff，1.2 uL MgCl2(1.5 mmol/L)，1.6 uL dNTPs(0.2 mmol/L)，1uL引物(0.5 Umol/L)，0.5 uLDNA Taq聚合酶U(1U)。

PCR反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环，72 ℃延伸10 min。ISSR-PCR扩增产物以Marker DL 2000作为分子量标准，用含有Gold View的2%琼脂糖凝胶于140 V恒压电泳。电泳结束后用凝胶成像系统仪拍照保存。

2.2.3．数据处理与统计分析

ISSR是显性标记，其判定的标准是：若一对引物产生的扩增产物电泳率一致，则这对条带则被认为同源。按照扩增产物在相对迁移位置条带的有无来进行统计，有带记为“1”，无带记为“0”，利用Excel电子表格构建二元数据矩阵。遗传变异各项参数用Popgene 1.32软件进行分析，其中包括多态位百分率（PPB）、Shannon多样性信息指数（Ho，在物种水平上为Hsp，在居群水平上为Hpop）、Nei’s基因多样度指数（H）、平均每个位点上的观察等位基因数（Na）、平均每个位点的有效等位基因（Ne）；利用NTSYSpc2.1软件进行数据处理，采用Nei（1987）方法计算遗传相似系数（genetic similarity）GS=2 Nij/（Ni+Nj），式中Ni和Nj分别为i和j两材料的总等位位点数，Nij为i和j 两材料的共有等位位点数。遗传距离（genetic distance）GD＝1-GS。利用GD值按非加权成对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，构建树状聚类图。

3．结果与分析

3.1．引物筛选及ISSR-PCR扩增多态性分析

利用ISSR-PCR方法从80条通用引物中筛选出条带清晰、多态性丰富、重复性好的16条ISSR引物（见表2），对10份供试百合种质材料进行PCR扩增，并对扩增结果进行电泳检测。结果表明，16条随机引物共扩增出96个清晰可重复的有效条带，每条引物平均扩增6条带，扩增片段大小在100~2000 bp之间。同时，不同材料ISSR多态性因引物不同而有所变化，其中，P12和P21扩增效果较差（都为3条），多态性相对较差，而3A31扩增效果最好，共扩增出9条带纹，且多态性条纹9条；在总体96个位点的DNA片段条带中，其中具有多态位点的有77个（见表2），其多态性位点百分率（PPB）为80.2%，表明供试材料间遗传多样性水平较高。

将梵净山野生百合材种质材料和对照种质材料分为两个居群，结果（见表3）显示：5种梵净山野生百合种质材料的平均有效等位基因（Ne）为1.5411，平均Nei’s基因多样性指数（H）为0.2855，平均Shannon多样性信息指数（Hpop）为0.4101；而5种对照百合相对应的参数均低于梵净山野生百合，表明梵净山野生百合的遗传多样性水平较对照百合高一些。

3.2．遗传距离分析

通过Nei-Li相似系数法对10份供试材料的遗传相似系数（GS）进行了估算（表4），GS值在0.4565~0.913之间，表明遗传多样性较丰富；10份材料间遗传距离GD在0.0870~0.5435之间，平均为0.3785，种质材料间的遗传基础相对狭窄，种间遗传差异较小，种间遗传分化程度较低。

表2 本研究所用的ISSR引物及位点多态性

3.3．聚类分析

利用NTSYSpc2.1软件中的SHAN程序进行UPGMA聚类，构建树状聚类图（见图1）。结果表明，所有材料被分为2大类：梵野1号，梵野2号，梵野3号、巴特斯替洛和川百合聚在一类中，梵野4号、观赏百合1号、观赏百合2号、梵野5号和索邦百合聚在一起。在第一类中，梵野2号和梵野3号最先聚在一起，且遗传距离短，说明二者亲缘关系较近，而梵野1号单独聚为一类，与其他四个的亲缘关系较远；第二大类中，在遗传相似系数0.68处，梵野4号和梵野5号单独聚类，亲缘关系相对较远，这一结果与居群间的遗传距离（或遗传一致性）分析结果是一致的。

图1 供试百合材料的UPGMA聚类图

4．讨论

4.1．野生百合种质资源的遗传多样性分析

与形态学标记相比，分子标记能直接反映基因组DNA 的遗传变异信息，有助于了解种质资源之间的遗传差异，对于种质资源的合理利用具有重要意义。结果表明，16条引物共扩增出96条带，其中多态性条带77条，多态性位点百分率高达80.2%，Nei’s 基因多样性指数、Shannon’s 信息指数分别为0.2855和0.4101，说明百合种质资源具有较高的ISSR多态性，遗传变异也较为丰富。

表3 供试百合的遗传多样性

表4 10份供试材料的遗传距离

4.2．百合种质资源的保护策略

基于ISSR标记分析了10份百合材料的亲缘关系，品种间的遗传基础相对稳定，其中5种梵净山野生百合种质材料间遗传差异较小，这可能是由于本研究选用的野生百合材料都属于当地野生种质资源，未经过特异的驯化和变异[12-13]。本研究收集到的5个梵净山野生百合种质材料都可在梵净山区域良好生长。因此，迁地保护是梵净山野生百合资源保存的办法之一。从遗传多样性的有效保护来说，迁地保护的价值是通过一个居群的遗传多样性应达到或至少接近物种水平上的遗传多样性体现出来的。充分重视居群内不同类型个体的迁地保护，并且在迁地栽培后加快对梵净山野生百合的大规模繁育技术研究，加强对当地农户的科普教育，防止滥采滥挖，以适当的开发利用促进对野生资源的就地保护[14]，使梵净山百合保持较高水平的遗传多样性，降低该种变成濒危物种的风险。

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Genetic Diversity of Wild Lily Germplasm Resources from Fanjing Mountains Based on ISSR

YAO Qifu1, WANG Ting2, QIU Lan1

( 1.College of Agroforestry Engineering and Planning, Tonren university, Tongren 554300, Guizhou, China; 2.College of Biology and Environmental Science, Jishou university, Jishou 416000, Hunan, China )

Using ISSR molecular marker method, with five kinds of wild lily in Fanjing Mountainain and five control lily varieties of wild lily germplasm resources, the genetic diversity analysis, using 16 random primers amplification out 96 clear repeatable stripe effectively, average each primer amplification bands 6, amplified fragment size between 100~2000 bp, of which 77 loci are polymorphic, the percentage polymorphism loci (PPB) was 80.2%, indicate that the genetic diversity among the germplasms level is higher. (2) the genetic similarity coefficient (GS) of 10 tested materials was estimated by nei-li similarity coefficient method. The GS value was between 0.4565 and 0.913, indicating that the genetic diversity was relatively rich. The genetic distance between the 10 materials was between 0.0870 and 0.5435, with an average of 0.3785. The genetic basis between the germplasm materials was relatively narrow, with small inter-species genetic differences and low inter-species genetic differentiation. (3) UPGMA clustering results showed that the wild lily no. 2 and wild lily no. 3 of Fanjing Mountain were closer than the other three wild lily no. 3 of Fanjing Mountain. This study provides reference for the protection, breeding and development of wild lily species in Fanjing Mountain.