红曲霉合生元对松辽黑猪血清指标及背最长肌中MSTN、MyoD基因mRNA相对表达量影响

高 凯， 张 敏 张宗伟， 李 娜， 张树敏

(1.延边大学农学院， 吉林 延吉 133002； 2.吉林省农业科学院畜牧分院，吉林 公主岭 136100)

随着生活质量的提高，人们对瘦肉的需求逐步增加，促使猪的养殖朝高瘦肉率的方向发展。目前，主要通过培育新品种或改善饲养方式的方法来提高猪的瘦肉率。饲料添加剂作为改善饲养方式的一种，得到了畜牧工作者的广泛认可，但是，带有抗生素和瘦肉精的饲料添加剂所带来的危害，又给猪肉的消费带来了负面影响，因此，无抗饲料添加剂的研发势在必行。而微生态生物制剂—红曲霉合生元的出现，在一定程度上可以同时提高畜禽产品的数量与质量。红曲米和中药混合发酵后称为红曲酶合生元。其中，红曲霉发酵物具有降低血清胆固醇[1-2]、抗氧化[3-4]、增强免疫力、抗应激[5]的疗效，也具有机体组织着色、食品保质[6]、预防心血管系统疾病等功能，添加到畜禽饲粮中具有增强生产性能，提高畜禽产品质量的功效[7]。而红枣、山楂和神曲按照一定比例配伍，具有健脾开胃的功效，中药纤维可以刺激胃肠道蠕动，促进肠道有益菌形成优势菌群，维护肠道健康[8-9]，促进动物机体对营养物质的吸收利用。课题组前期研究证实，该合生元可以提高断奶仔猪及育肥猪的生长性能[10-12]，也证实合生元可以改善蛋鸡血液指标[13]，鉴于此，本试验以饲喂育肥期松辽黑猪添加不同浓度红曲酶合生元的饲粮，研究其对育肥期松辽黑猪日增重、瘦肉率、血清蛋白、血清转氨酶活性和血脂指标的影响，探究其对背最长肌中MSTN、MyoD基因mRNA相对表达量的影响，探讨其对提高瘦肉率是否有效，为红曲酶合生元的后续研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

红曲霉合生元制作：将饲料级大米与饲料级红枣、山药、神曲、山楂一起蒸熟，放在高压灭菌锅中(121 ℃、20 min)，灭菌后接种红曲霉(中国菌种保藏中心，菌种编号：5004；10代改良的耐药性菌株)，发酵14 d后，于烘干箱(45 ℃、72 h)中烘干，粉碎成80目，按比例添加到育肥猪饲粮中。经检测，样品中淀粉酶活力248 U/g,红曲色素含量为2.0 mg/g，Monacolink含量为2.2 mg/kg。

1.2 试验设计

采用单因素试验设计，选60头初始体重为(70.00±2.16) kg的松辽黑猪，随机分为3组，每组5次重复，每重复4头(公母各半)。对照组饲喂不添加红曲霉合生元的基础饲粮，其参照中国农业部颁布的猪饲养标准(NY/T 65-2004)配制的粉状配合饲料，基础饲粮组成及营养水平见表1。表1中：1) 预混料为每千克饲粮提供VA 4 400 000 IU，VD31 500 000 IU，VE16 000 IU，VK3800 mg，VB1700 mg，VB22 400 mg，VB61 200 mg，VB128.4 mg，烟酸145 000 mg，泛酸5 800 mg，叶酸400 mg，生物素70 mg，氯化胆碱75 g，Fe 26 g，Cu 40 g，Zn 160 ，Mn 7.6 g，I 100 mg，Se 125 mg;2) 粗蛋白质、钙和总磷为实测值，其余为计算值。

试验A、B组饲喂的基础饲粮中红曲霉中药合生元添加比例分别为0.5%、1.0%。预饲期7 d，试验期60 d，共67 d 。

表1 基础饲粮组成及营养水平 (风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)

1.3 饲养管理

试验猪自由采食(粉料，每日饲喂3次)，自由饮用清洁水。定期清理圈舍内粪便，保证猪舍地面洁净、空气清新，定期巡视猪的生活状况，免疫程序与猪场一致。采集血样前，保证12 h空腹状态。

2 样品的采集与分析方法

2.1 样品采集

在饲养试验结束时，每重复随机选取2头育肥猪，用规格10 mL的采血针进行前腔静脉采血，注入普通采血管中。静止30 min后，放入离心机(3 500 r/min、15 min)，抽取分离血清，保存在 -20 ℃条件下，以备各项指标的检测。育肥猪屠宰后，每头取背最长肌200 g，放入液氮中速冻2 h，放至-80 ℃冰箱保存，备用。

2.2 血清相关指标检测

总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(AST)、谷酰转氨酶(GT)、碱性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)均采用试剂盒检测，购自南京建成生物工程研究所。球蛋白(GLO)=TP-ALB。

2.3 半定量RT-PCR法分析MSTN、MyoD基因mRNA 相对表达量

参照与Genbank中登录号为NM_214435的MSTN基因序列、登录号为SSU12574的MyoD基因序列和β-actin 基因序列，利用生物软件primer 5.0和oligo 7.0结合设计引物(表2)，并由上海英骏生物技术有限公司合成。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

取背最长肌组织样品100 mg放入研钵内，加液氮迅速研磨至粉糊状，采用Trizol法提取总RNA样品，再检测其浓度和OD值( D260nm/ D280nm=1.8～ 2.0)。取样本cDNA 1 μL进行PCR扩增反应，用1.0%琼脂糖凝胶进行凝胶电泳检查电泳产物的PCR扩增情况。同时将PCR扩增产物的凝胶纯化，得到PCR扩增产物的胶体溶解后的回收液。电泳后，割胶并用pGEM-T easy Vector systemⅠ试剂盒将回收纯化的PCR产物与T-vector载体连接(冰块上操作)。低温(4℃)培养18 h后，同时取4 μL标准质粒DNA、培养物分别倒进200 μL感受态细胞(CaCl2法培养)中，进行目的DNA的转化。

2.4 平均日增重和瘦肉率

平均日增重(ADG)=(育肥猪末重-育肥猪初始重)/试验期;

瘦肉率(lean percentage；LP)=瘦肉重/(瘦肉重+脂肪重+皮重+骨重)×100%。

2.5 数据统计分析

用凝胶电泳自带分析软件对MSTN、MSTN基因电泳条带相对于β-actin基因的IOD(Integrated Optical Density)值进行半定量分析并记录数据。用Excel 2010软件整理数据，并采用SPSS 20.0数据统计软件进行单因素方差分析，考察不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪相关血清指标及背最长肌中MSTN、MyoD基因mRNA相对表达量是否有影响，同时采用LSD法进行多重比较。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。结果以(平均值±标准差)表示。

3 结果与分析

3.1 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪血清蛋白指标的影响

由表3可以看出，与对照组相比，A组与B组的血清TP含量分别提高了4.54%(P<0.05)和4.74%(P<0.05)，血清GLO含量分别提高了23.95%(P<0.05)和24.29%(P<0.05)；但A组与B组之间没有显著性差异(P>0.05)。各组间血清ALB含量无显著性差异(P>0.05)。

表3 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪血清蛋白指标的影响Table 3 Effect of different levels of Monascus symbiotic on serum protein indices in Songliao Black Pigs (g/L)

注:同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，下同。

3.2 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪血清酶活性指标的影响

由表4可知，与对照组相比，A组和B组的血清GPT分别下降了1.49%(P<0.05)和1.42%(P<0.05)，但A组与B组之间无显著性差异(P>0.05)。各组间血清AST、GT、ALP均无显著性差异(P>0.05)。

表4不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪血清酶活性指标的影响

Table4EffectofdifferentlevelsofMonascussymbioticonserumenzymeactivitiesinSongliaoBlackPigs(U/L)

项目对照组A组B组谷丙转氨酶GPT31.60±6.67a31.13±5.83b31.15±4.83b谷草转氨酶AST62.33±14.3862.25±9.8762.35±8.89谷酰转氨酶GT339.10±130.11339.67±126.12340.27±123.54碱性磷酸酶ALP363.93±121.71364.55±109.34362.45±101.14

3.3 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪血脂指标的影响

由表5可知，关于血清TG含量，A组比对照组降低了3.85%，但差异不显著(P>0.05)，B组比对照组降低了11.54%(P<0.05)、比A组降低了8.00%(P<0.05)。关于血清TC含量，A组和B组分别比对照组降低了30.89%(P<0.01)和31.81%(P<0.01),且B组比A组降低了1.32%(P<0.05)。各组间血清HDL、LDL含量均无显著性差异(P>0.05)。

表5 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪血脂指标的影响Table 5 Effect of different levels of Monascus symbiotic on blood lipids in Songliao Black Pigs (mmol/L)

3.4 各组松辽黑猪背最长肌中MSTN、MyoD基因cDNA质量检测

逆转录cDNA为模板，MSTN和MyoD RT-PCR产物分别经1%琼脂糖电泳，显示扩增分别得到大小约为282和271 bp左右的片段，与设计的产物大小很相近，对比分析发现：同源性分别为97.5%和97.8%。将其中与目的基因相近的条带割胶回收后电泳，显示出清晰的目的DNA条带(图1，2)。

M：DNA marker P：PCR产物

M：DNA marker P：PCR产物

3.5 各组松辽黑猪背最长肌中MSTN、MyoD基因RT-PCR检测

根据半定量RT-PCR方法对不同合生元添加量的松辽黑猪背最长肌中MSTN、MyoD基因的表达进行PCR扩增及电泳检测，检测结果如图3，4所示。

图3 不同红曲酶合生元松辽黑猪背 最长肌中MSTN基因电泳图谱

图4 不同红曲酶合生元松辽黑猪背最长肌 中MyoD基因电泳图谱

在相同电泳条件下，与对照组相比，试验A组、B组MSTN基因条带偏灰暗、MyoD基因条带偏明亮；表明试验A组、B组松辽黑猪背最长肌中MSTN基因表达量少于对照组、MyoD基因表达量多于对照组。

3.6 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪背最长肌中MSTN、MyoD基因mRNA相对表达量的影响

由表6可知，与对照组相比，A组和B组MSTN基因mRNA相对表达量分别降低了8.46%(P<0.05)和9.23%(P<0.05)；MyoD基因mRNA 相对表达量分别提高了12.22%(P<0.05)和17.78%(P<0.05)；以上指标，A组与B组之间均无显著性差异(P>0.05)。

表6 MSTN、MyoD基因相对表达量Table 6 Relative expression of MSTN and MyoD genes

3.7 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪日增重和瘦肉率的影响

由表7可知，与对照组相比， ADG分别提高了19.76%(P<0.05)和26.85%(P<0.05)；LP分别提高了4.02%(P<0.05)和5.76%(P<0.05)；以上指标，A组与B组之间均无显著性差异(P>0.05)。

表7 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪日增重和瘦肉率的影响Table 7 Effects of different levels of Monascus symbiotic on the daily gain and lean meat percentage of Songliao Black Pigs

4 讨论

4.1 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪血清指标的影响

瘦肉率的提高与育肥猪的营养代谢能力及肝脏健康水平密切相关。合生元中的次级代谢产物MonacolinK是降血脂的有效成分，且有研究表明红曲相关制品比纯的MonacolinK效果更为显著[14-15]。合生元中的神曲可以消除积食，提高育肥猪的采食量，促进氨基酸的消化吸收，促进血清蛋白升高；山楂含有牡荆素、叶黄酮类化合物、槲皮素、山楂酸等8种具有降血脂功效的物质[16-17]，同时山楂果皮、果肉多酚和种子具有消炎、护肝的功效[18-19]。大枣中多糖、多酚类物质可以清理血清TC，提高血清TP含量 ，保护肝脏[20]。血清TP代表育肥猪体内氨基酸代谢、吸收状况，正常范围内，含量越高，体内蛋白质沉积越好。在育肥猪饲粮中添加红曲酶中药合生元，猪体内血清总TP与GLO含量显著性升高，表明该合生元可以增强机体蛋白质代谢能力，促进氨基酸的吸收利用，同时也提高了免疫力。这与齐雪[11]的研究红曲酶中药合生素可以提高断奶仔猪生长和免疫性能相一致。

肝脏细胞损伤后，胞内酶(AST、GPT等)大量释放到血液中，因此血清GPT、AST、GT、ALP含量是诊断肝功能的重要指标，在正常范围内，活性降低表示育肥猪利用蛋白的能力升高，有利于维护肝脏的正常功能。饲喂添加红曲酶合生元的育肥猪血清GPT显著降低，血清AST、GT、ALP水平无显著影响，表明该合生元不仅不会对育肥猪肝脏产生危害，而且具有改善肝脏功能的作用，这与郑博文等[13]的研究结果相似。

血清TG、TC、HDL和LDL含量是育肥猪体内胆固醇代谢的重要指标。饲喂添加量为1.0%红曲酶中药合生元的育肥猪血清TG水平明显低于对照组与0.5%组；饲粮中添加该合生元的育肥猪血清TC含量均极显著低于对照组，且添加量为1.0%的组显著低于添加量为0.5%的组，表明饲粮中添加该合生元，有利于降低育肥猪血脂水平，且添加量愈多，效果愈显著，这与郑博文等[13]得出的红曲酶中药合生元可以显著提高蛋鸡血清HDL、LDL含量略有不同。本试验中与转运胆固醇相关的血清HDL、LDL含量有下降趋势，可能是由于添加合生元的育肥猪长期保持低胆固醇状态，机体内合成HDL、LDL的量降低，具体机理需进一步研究。试验数据表明，合生元的添加可以改善育肥猪的血液指标，提高其对氮的代谢和沉积能力。

4.2 不同水平红曲酶合生元对松辽黑猪背最长肌中MSTN、MyoD基因相对表达量及肌肉沉降质量的影响

育肥猪的生长速度和瘦肉率与肌细胞生长和肌纤维数目密切相关。肌肉的生长发育是由大量生肌调控因子共同协同作用。MSTN基因(肌肉抑制素)属于TGFβ(transforming growth factor beta)超家族的成员[21]。1999年，Stratil等克隆出猪的MSTN基因[22]。研究发现，除了通过Smad蛋白家族介导的信号传递外，MSTN还可以通过其他的信号通路调控下游蛋白的转录。MSTN可以通过激活体内的p38信号通路(借助TAK1-MKK6信号级联放大反应)和TAKI/Ras信号通路，调控成肌细胞的增殖与分化[23-24]。总体而言，MSTN基因在各物种中，都对骨骼肌的生成有显著的负调控作用；对动物脂肪细胞的生成有正调控作用[25]。在胚胎发育初期， MyoD基因家族的4个基因最先调控肌肉的分化发育[26]。家族中的Myf5和MyoD基因最为关键，Myf5首先参与肌细胞增殖，随后MyoD开始表达，诱导细胞周期的退出和细胞分化的开启[27-28]。当细胞增殖完成时，MyoD基因启动分化基因MyoG表达，促进细胞全面分化。ADG与LP代表育肥猪的肌肉生长能力和总体肌肉沉降质量。本试验数据表明：育肥猪饲粮中添加红曲酶合生元，可以显著降低MSTN基因mRNA相对表达量，升高MyoD基因mRNA相对表达量，进而促进育肥猪体内肌细胞的增殖、分化，减缓脂肪细胞的生成，显著提高了育肥猪ADG和LP，且随着红曲霉合生元添加量的增加，效果更明显。这与齐雪[11]、张宗伟等[12]研究结果相一致。但红曲霉合生元对脂肪细胞影响的具体机制尚不清楚，仍需后续细胞培养试验进行研究。

5 结论

本试验饲喂育肥期松辽黑猪添加不同浓度红曲酶合生元的饲粮，并检测血清蛋白、血清转氨酶活性、血脂指标以及背最长肌中MSTN、MyoD基因mRNA相对表达量，结果表明：育肥期松辽黑猪饲粮中添加红曲酶合生元，可以显著降低血清胆固醇，改善肝脏功能，促进育肥猪对蛋白代谢和沉积；可以显著降低背最长肌中MSTN基因mRNA相对表达量，提高背最长肌中MyoD基因mRNA相对表达量，加强肌肉的沉积，提高瘦肉率。建议添加量为0.5%。