脓肿分枝杆菌16S rRNA检测及生物学特性研究

孙铭艳 吴倩倩 王业鑫 王楠 刘言霞 陶元勇

261031山东，潍坊医学院附属医院检验科（孙铭艳、吴倩倩、王楠、刘言霞、陶元勇），关节外科（王业鑫）

脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）是一种非结核分枝杆菌［1］，生长迅速，7 d内可形成肉眼可见的菌落，主要寄生在人和动物的消化道和呼吸道内，广泛分布于土壤、食物、水源等处［2］。该菌常引起皮肤和软组织感染，多见于注射污染、手术伤口引起的局部感染和脓肿［3］。我们对1例患者左膝关节内侧皮下软组织脓液中分离的脓肿分枝杆菌进行生物学特性研究及16S rRNA基因检测，探索脓肿分枝杆菌的鉴定方法。

一、临床资料

患者女，60岁，因左膝内侧皮肤红肿热痛1个月余，于2017年12月18日就诊。患者1个月前发现左膝关节内侧皮肤红肿，局部皮温升高，触痛明显，局部无皮肤破损，无发热、咽痛等全身不适，自行用“药酒”治疗无效，红肿范围逐渐增大，可触及皮下硬结。左膝关节内侧核磁共振示皮下软组织水肿，局部穿刺，抽出约10 ml脓液。患者自发病以来，精神状态尚可，饮食及大小便正常，体重较前无明显变化。

二、细菌培养与鉴定

1.细菌培养：将脓液标本接种于哥伦比亚血平板，35℃孵育48 h，取菌落行革兰染色及抗酸染色镜检，触酶试验、硝酸盐还原试验、尿素分解试验观察生化反应特性。

2.药敏试验：采用比例法［4］，将分离菌接种于分枝杆菌药敏罗氏培养基，根据药敏培养基上生长菌落数与对照培养基上生长菌落数之比判定药物敏感性，如果耐药百分比大于1%报告耐药，否则报告敏感。

3.基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱鉴定：用定量接种环取1 μl菌，加入到含直径0.5 mm玻璃珠的1.5 ml离心管，加入70%乙醇500 μl，涡旋振荡混匀并将全部液体转移到2 ml圆底无色离心管中，10 000×g离心2 min，弃上清液，先后加入70%甲酸、乙腈各10 μl，涡旋振荡。取1 μl标本涂于靶板，加入1 μl CHCA（α-氰基-4-羟基肉桂酸+乙腈）基质液，待完全干燥后，使用MALDI-TOF质谱仪（法国梅里埃公司）鉴定，将所得质谱图与标准数据库中的质谱图进行匹配。

4.16 S rRNA基因检测：取哥伦比亚血平板上的菌落接种于肉汤培养基中，孵育过夜，将1 ml菌液加入到1.5 ml离心管中，4 250×g离心1 min，弃上清液，收集菌体，按Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取基因组DNA。基因组DNA PCR扩增16S rRNA基因，按试剂盒说明操作，正向引物 5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，使用自动凝胶成像系统分析。从PCR产物电泳条带上切割所需DNA目的条带，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收后测序。试剂盒、引物及测序服务均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。测序后与GenBank数据库中已知脓肿分枝杆菌的16S rRNA基因比对。

三、结果

1.细菌培养：培养48 h，无肉眼可见的菌落；培养96 h，可见直径约1 mm的淡黄白色、湿润、油滑感菌落，无溶血环（图1）。菌落涂片革兰染色阳性（图2），抗酸染色阳性（图3），触酶试验阳性，硝酸盐还原试验阴性，尿素分解试验阴性。

图1 脓液标本培养96 h，可见直径约1 mm淡黄白色、湿润、油滑感菌落，无溶血环

图2 菌落涂片革兰染色阳性

图3 菌落涂片抗酸染色阳性

2.药敏试验：该菌对阿米卡星、莫西沙星、左氧氟沙星敏感，对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卡那霉素、卷曲霉素、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺、利福布汀耐药。

3.鉴定：分离菌株的MALDI-TOF质谱图与数据库中已有的脓肿分枝杆菌质谱图比较，吻合度最高，鉴定为脓肿分枝杆菌，置信度为99.9%（图4）。菌落的基因组DNA PCR产物约为1 380 bp（图5），测序后与已知脓肿分枝杆菌的16S rRNA基因相似性为99%，用MEGA7软件构建分离菌的系统进化树，可见分离菌与脓肿分枝杆菌位于同一分支（图6），鉴定为脓肿分枝杆菌，登录号为NR 074427.1。

图4 脓肿分枝杆菌质谱图 分离菌株与数据库中已有的脓肿分枝杆菌质谱图吻合度最高，鉴定为脓肿分枝杆菌

图5 脓肿分枝杆菌临床分离株16S rRNA基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳 基因组DNA PCR产物长度约为1 380 bp。M：DNA标准参照物；1：产物DNA

图6 脓肿分枝杆菌临床分离菌株的系统进化树 分离菌与脓肿分枝杆菌位于同一分支，鉴定为脓肿分枝杆菌

4.诊断：左膝关节皮下软组织感染。

5.治疗：根据药敏试验结果，给予静脉滴注阿米卡星0.2 g/d、左氧氟沙星0.3 g/12 h，并实施左膝脓肿引流术，治疗13 d后，患处无明显渗出物，肿胀消退，应患者要求出院。出院后3个月随访，患处无明显渗出物，无红肿，症状好转。

四、讨论

脓肿分枝杆菌常引起皮肤感染，人和动物均可致病，早期可表现为红肿、硬块，晚期表现为局限性及多发性脓肿［5-6］。本分离菌来自患者的皮下脓肿，革兰染色、抗酸染色均阳性，菌落有油滑感，初步判断为非结核分枝杆菌。目前细菌鉴定方法大多采用生化反应及血清学检测等，存在时间长、准确性差等缺点，全自动细菌鉴定分析仪也只能鉴定有限的细菌。近来，分子生物学方法广泛应用于细菌菌种的鉴定，具有快速、准确等优点［7］。细菌的rRNA包括5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，其中16S rRNA具有含量多、分子量适中、高度保守等特点，所以，16S rRNA基因测序常用于细菌鉴定［8-9］。

近年来，MALDI-TOF MS广泛应用于临床实验室细菌及真菌鉴定［10-11］，其对革兰阳性球菌、肠杆菌科细菌、非发酵菌等临床常见细菌的鉴定准确率均大于96%，对非结核分枝杆菌的鉴定准确率为94.60%［12］。本研究使用MALDI-TOF MS检测分离株，得到的质谱图与数据库中已有的脓肿分枝杆菌质谱图比较，吻合度最高，置信度为99.9%。同时也通过扩增分离菌株的16S rRNA与GenBank数据库中的序列进行同源性比较显示，与已知脓肿分枝杆菌的相似性为99%，由分离株的系统进化树可知，该分离菌与Mycobacterium abscessus位于同一分支，鉴定为脓肿分枝杆菌，登录号为NR 074427.1。

综上所述，本文患者分离菌株经MALDI-TOF MS与16S rRNA基因检测，鉴定为脓肿分枝杆菌，是导致患者左膝关节内侧皮肤脓肿的主要致病菌，根据药敏试验结果给予相应治疗后，患者病情好转。