咖啡酸衍生物WSY6对黑素细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究

金嵘 祝逸平 林福全 刘东银 傅丽芳 许爱娥

310009杭州市第三人民医院皮肤科

白癜风的发病机制不明确［1］，治疗相对困难。近年氧化应激学说被大家普遍关注，被认为是白癜风可能的发病原因之一。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）具有抗氧化活性［2］，对人肝细胞氧化损伤具有保护作用［3］，能使肾细胞免受氧化应激损伤［4］。但EGCG脂溶性差，生物利用度低，不易被皮肤吸收，影响其在药物方面的应用［5］。我们在EGCG构型改造中发现一种新的衍生物即咖啡酸衍生物WSY6。已有研究发现咖啡酸及其衍生物具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤和免疫调节等作用［6-9］。为了验证WSY6在抗氧化方面的作用，本研究探讨WSY6对过氧化氢（H2O2）诱导的黑素细胞损伤的抗氧化应激作用和潜在的分子机制，为白癜风的抗氧化治疗提供理论基础。

材料与方法

一、试剂和仪器

F12培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清产自美国Gibco公司；单溶液细胞增殖检测（MTS）试剂盒和乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒产自美国Promega公司；霍乱毒素、二甲基亚砜（DMSO）、异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）产自美国Sigma公司；Western印迹实验所用抗体包括抗β肌动蛋白、细胞色素C（cyto-c）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、caspase-9以及磷酸化p38、ERK、JNK、p53（p-p38、p-ERK、p-JNK、pp53）抗体均产自美国CST公司；活性氧（ROS）检测试剂盒和Western印迹上样缓冲液来自上海碧云天生物技术有限公司；WSY6（纯度大于95%）由浙江大学药学院合成。Spectra Max酶标仪为美国MD公司产品，Facsealibur流式细胞仪为美国BD公司产品，Odyssey双色红外荧光成像系统产自美国LICOR公司。

二、人表皮黑素细胞分离培养及细胞毒性实验

人表皮黑素细胞来源于杭州市第三人民医院泌尿外科健康人环切包皮（取材前获得供者知情同意）。用虹膜剪沿包皮壁剪下，用0.25%胰酶及0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）先后在37℃消化10 min；在立体显微镜下刮下角质层下及真皮上的细胞，1 000 r/min（离心半径5 cm）离心5 min，收集沉淀细胞重新悬浮于Hu16培养基中，37℃、5%CO2条件下培养后，接种至96孔板，每孔1×104个细胞，加入100 μl Hu16培养液。培养过夜，细胞贴壁后吸弃培养液，分别加入含0、0.39、0.78、1.56、3.12、6.24、12.5、25、50、100 μmol/L的WSY6培养基培养24 h，然后加入MTS试剂，37℃培养1 h，用酶标仪测定A490值。每组设3个复孔，重复3次。细胞存活率=（实验组A490值-空白对照组A490值）/（对照组A490值-空白对照组A490值）×100%。

三、MTS法测定细胞存活率

向96孔板中加入对数生长期的黑素细胞（每孔1 × 104个），分为对照组、H2O2组以及6.25、12.5、25 μmol/L WSY6组：先向WSY6组中分别加入6.25、12.5、25 μmol/L WSY6预处理1 h，用Hu16培养基洗涤后，向H2O2组和WSY6组中分别加入1 mmol/L H2O2培养1 h，用Hu16培养基洗涤3次后，向所有组即对照组、H2O2组和WSY6组中加入培养基继续培养24 h。加入MTS，37℃培养1 h，用酶标仪测定A490值。每组设3个复孔，重复3次。按上述方法计算各WSY6组计算细胞存活率。

四、黑素细胞LDH水平测定

部分黑素细胞分组处理方法同MTS实验，培养24 h后，按LDH试剂盒说明书测定各组细胞培养上清液中LDH含量，设定不做任何处理的黑素细胞裂解液中的LDH含量为100%。实验重复3次。将部分黑素细胞分为抑制剂组和H2O2组：先用p38抑制剂（SB203580，美国Selleck公司）预处理抑制剂组1 h后，向H2O2组和抑制剂组加入1 mmol/L H2O2处理1 h，用Hu16培养基洗涤3次后继续培养24 h，之后按LDH试剂盒说明书测定各组LDH释放量，LDH释放量=（实验组上清液A490-空白上清液A490）/（全裂解组A490-空白裂解组A490）×100%。

五、流式细胞仪测定黑素细胞ROS水平

将黑素细胞接种于6孔板，每孔细胞数量为3×105个，细胞贴壁后，将其分为对照组、H2O2组、WSY6组：先用25 μmol/L WSY6预处理WSY6组细胞1、2、4 h，再用1 mmol/L H2O2分别处理WSY6组和H2O2组细胞1 h，用培养基轻轻洗涤，最后向对照组（前期不做任何处理）和所有实验组中加1 ml 10 mmol/L 2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF-DA），37℃避光放置30 min，加PBS悬浮细胞，用流式细胞仪测定胞内ROS水平。实验重复3次。

六、Western印迹法测定黑素细胞cyto-c、caspase-3、caspase-9等蛋白水平

将黑素细胞接种于6孔板，每孔细胞数量为3×105个，细胞分组及处理方法同MTS实验。处理完成后，收集并裂解细胞，提取蛋白，上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移到硝酸纤维素膜（NC），5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（包括鼠抗人β肌动蛋白、p-JNK抗体和兔抗人cyto-c、caspase-3、caspase-9、p-p38、p-ERK、p-p53抗体），4℃孵育过夜，洗膜后加入IRDye800标记的山羊抗兔IgG抗体，室温孵育1 h后用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描分析。实验重复3次。

七、统计学方法

采用SPSS 11.0软件分析，数据用±s表示。多个样本均数间比较采用单因素方差分析，各样本间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同浓度WSY6对黑素细胞的毒性作用

见图1。0.39～ 50 μmol/L WSY6作用24 h未对各组细胞产生明显的毒性作用，各WSY6组与对照组（100%）相比细胞存活率差异均无统计学意义（F=1.944，P＞0.05）。100 μmol/L WSY6作用后，细胞存活率降至92.0%±1.0%，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 不同浓度WSY6对黑素细胞存活率的影响 对照组（未加WSY6）细胞存活率为100%；a：与对照组相比，P＜0.05

二、不同浓度WSY6对氧化应激下黑素细胞活性的影响

显微镜下观察发现，H2O2组细胞树突缩短，细胞收缩并且贴壁细胞较少，而WSY6组细胞较H2O2组明显好转，且浓度越高保护效果越好（图2）。H2O2组与对照组相比黑素细胞活性显著降低，而不同浓度WSY6预处理后，细胞存活率与H2O2组相比显著上升（P＜0.05），且呈浓度依赖性（r值为0.928，P＜ 0.05）（表1）。

图2 WSY6对H2O2诱导的黑素细胞形态的影响（×100） 对照组黑素细胞呈树突状，多个细长的突起连接成网状；H2O2组树突明显缩短消失，细胞贴壁数量减少；12.5 μmol/L WSY6组贴壁细胞数量增多，树突无明显回缩；25 μmol/L WSY6组细胞状态较好，贴壁细胞明显增多

表1 不同浓度WSY6预处理对H2O2诱导的黑素细胞增殖活性和乳酸脱氢酶（LDH）释放量的影响（±s）

表1 不同浓度WSY6预处理对H2O2诱导的黑素细胞增殖活性和乳酸脱氢酶（LDH）释放量的影响（±s）

注：n=3。a与对照组相比，P ＜0.05；b与H2O2组相比，P＜ 0.05

对照组H202组6.25 μmol/L WSY6组12.5 μmol/L WSY6组25 μmol/L WSY6组F值P值细胞存活率（%）100.02±1.00 29.22±1.31a 52.48±1.17b 60.21±0.25b 78.32±1.73b 353.97＜0.05 LDH释放量（%）7.59±0.85 47.19±4.85a 21.99±0.22b 15.38±0.45b 13.18±0.38b 34.41＜0.05

三、不同浓度WSY6对黑素细胞LDH释放量的影响

各组LDH测定水平见表1。H2O2处理后，细胞LDH释放量较对照组显著上升（P＜0.05）。各浓度WSY6预处理1 h后，LDH释放量较H2O2组明显降低（P＜0.05），且呈浓度依赖性下降（r=-0.949，P＜0.01）。p38抑制剂组黑素细胞LDH释放量为43.95±1.35，H2O2组为35.70± 1.05，两组差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

四、WSY6对黑素细胞ROS水平的影响

设定对照组细胞内ROS水平为1，H2O2组黑素细胞内ROS水平上升至18.37±1.59，经25 μmol/L WSY6预处理1、2和4 h后，细胞内ROS水平分别下降至7.59± 1.00、6.22± 0.52、5.15± 0.48，与H2O2组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。而且，WSY6预处理时间越长，黑素细胞内ROS含量越低（r值为-0.838，P＜ 0.05）。

五、WSY6对黑素细胞凋亡相关蛋白表达的影响

正常黑素细胞仅少量表达cyto-c、caspase-3和caspase-9，经H2O2处理后，3种蛋白表达明显增加，但经WSY6预处理后cyto-c、caspase-3和caspase-9的表达明显受到抑制（图3）。H2O2处理后p-p38、p-ERK和p-JNK的表达较对照组均增加（图4）；WSY6预处理后，p-p38的表达较H2O2组降低，且WSY6浓度越高，降低越明显，而p-ERK和p-JNK的表达不受影响；同时p38 MAPK下游产物p-p53的表达也随WSY6浓度升高而下降。p38、ERK和JNK总蛋白水平经H2O2单独或联合WSY6处理后都无显著变化。

图3 WSY6预处理对H2O2诱导的黑素细胞细胞色素C、caspase-3和caspase-9表达的影响 1～5分别为对照组、H2O2组和6.25、12.5、25 μmol/L WSY6组

图4 WSY6预处理对H2O2诱导的黑素细胞p-p38、p-ERK、p-JNK和p-p53表达的影响 1～5分别为对照组、H2O2组和6.25、12.5、25 μmol/L WSY6组

讨 论

白癜风发病机制复杂，涉及遗传、免疫、氧化应激、功能性黑素细胞凋亡和丢失、神经精神等。目前研究显示，氧化应激机制参与白癜风的发生与发展，且与病情活动性相关［10］。本研究结果显示WSY6具有较好的抗黑素细胞氧化作用，能降低细胞内ROS水平和LDH释放量，抑制H2O2介导的cytoc、caspase、p-p38 MAPK释放，从而发挥保护黑素细胞的作用。

有研究发现，H2O2在白癜风的皮损部位堆积［11］，暴露于H2O2会增加黑素细胞胞内ROS水平，引起潜在的细胞毒性［12-13］，因此使用抗氧化剂去除ROS是治疗白癜风的一种有效手段。本研究证实，H2O2处理后细胞内产生ROS堆积，而WSY6预处理后细胞内ROS堆积量显著降低，且药物作用时间越长，ROS量的降低越明显。已有大量研究证实，MAPK家族成员参与细胞黑素生成［14］，包括p38 MAPK、ERK1/2和JNK等。而且ROS堆积异常可激发MAPK旁路，导致细胞凋亡和炎症反应［10］。我们的结果也证实H2O2可刺激黑素细胞p38 MAPK、ERK和JNK的磷酸化，但WSY6预处理能有效抑制H2O2介导的p38磷酸化。因此，激活p38 MAPK在H2O2介导的黑素细胞凋亡中起重要作用，而WSY6能通过抑制p38 MAPK的活性起到重要的保护作用。

总之，本实验表明，WSY6能通过降低细胞ROS水平、抑制p38 MAPK活性和cyto-c表达等，减弱H2O2介导的黑素细胞氧化应激损伤和凋亡，提示WSY6可作为一种治疗白癜风的潜在药物。