载血卟啉单甲醚高分子纳米粒用于光声显像引导下声动力治疗:实验研究

黄 菊，李 攀，王志刚，韩晓霞，刘逢秋

(重庆医科大学附属第二医院超声科 超声分子影像重庆市重点实验室，重庆 400010)

随着精准医疗和纳米医学的发展，诊疗一体化分子探针成为近年研究热点。利用高分子聚合物包载显像剂和药物分子，能够实现影像学介导下的精准治疗，提高药物的治疗效果。光动力治疗(photodynamic therapy， PDT)是近年来兴起的一种新型治疗方法，具有无创、低毒、高选择性和重复性好等优点，被用于抗肿瘤治疗[1-2]。因激光穿透性较差，限制了PDT的应用，使其主要用于治疗表浅器官肿瘤，而对深部肿瘤无法达到治疗效果，另外，临床上所用的光敏剂在注入人体后必须避光处理，这在一定程度上给患者造成不便[3]。为克服PDT的不足，声动力治疗(sonodynamic therapy， SDT)应运而生。超声无创、操作性好、组织穿透性强，SDT将超声波和声敏剂结合，通过超声空化作用、氧自由基产生氧化损伤等机制诱导细胞凋亡，抑制肿瘤增殖[4]，具有良好的应用价值。本研究以聚乳酸-乙醇酸(PLGA)高分子化合物包载血卟啉单甲醚(hematoporphyrinmonomethyl ether， HMME)，探讨其体外增强光声显像特性以及SDT效果，旨在制作一种光声成像引导下的SDT分子探针，在真正意义上实现诊疗一体化。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及仪器 主要材料：PLGA(PLGA-COOH聚合比50∶50，济南岱罡生物科技有限公司)；聚乙烯醇(PVA，Sigma)；HMME(上海笛柏化学品技术有限公司)；2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA，Sigma)，钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI，Sigma公司)；吖啶橙(acridine orange, AO)染料(上海碧云天生物技术公司)；人乳腺癌MDA-MB-231细胞(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)。

主要仪器：Sonics 630-0435声振仪；DF-101磁力搅拌器(上海增森仪器科技有限公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90光粒径测量仪； Hitachi S-3400N电子显微镜；岛津UV2500 UV-VIS紫外可见光分光光度计；BD FACS Vantage SE 流式细胞仪；低强度聚焦超声(low intensity focused ultrasound, LIFU)治疗仪(重庆医科大学超声分子影像学研究所研制)；Lecia TCSSP2激光共聚焦显微镜；Visual Sonics Vevo®LAZR光声成像系统。

1.2 包裹HMME的PLGA(HMME@PLGA)纳米粒的制备 采用双乳化法，将50 mg PLGA和2 mg HMME加入至2 ml二氯甲烷溶液中(油相)，常温振荡至完全溶解，加入200 μl双蒸水(水相)，在常温条件下以声振仪声振3 min，功率为100 W，再加入8 ml 4%PVA溶液进行第2次声振，以磁力搅拌器搅拌挥发二氯甲烷2 h，待二氯甲烷完全挥发，以双蒸水离心洗涤(10 000 r/min，5 min)数次，制备获得HMME@PLGA纳米粒，于4°C条件下保存。

1.3 基本特征观察 采用粒径仪检测纳米粒的粒径和表面电位，在光学显微镜、透射电镜和激光共聚焦显微镜下观察其形态特征，连续观察1周。

1.4 包封率、载药量和细胞存活率检测 配置不同浓度的HMME三氯甲烷溶液，以紫外分光光度计测量其吸光度并绘制标准曲线，通过标准曲线计算出包封率及载药量。将10 μl浓度为1 mg/ml的HMME@PLGA纳米粒与人乳腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育24 h，采用CCK-8法检测细胞存活率。

1.5 体外光声显像 称取一定量琼脂，加入适量脱气水，以微波炉加热，搅拌至气泡消失，然后将EP管底部插入凝胶内并固定，待其冷却凝固后取出，制作带孔的凝胶模型。配制不同浓度(1、2、4、8、16 mg/ml)的HMME@PLGA纳米粒溶液，分别加入至不同的凝胶孔内，同时在另外2个凝胶孔内加入等量的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline， PBS)和0.48 mg/ml的HMME原液(采用浓度为16 mg/ml HMME@PLGA溶液，用量根据包封率计算，使其包载的HMME量为0.48 mg/ml)，在690 nm激光辐照后，以光声成像系统采集得到体外光声图。

1.6 体外活性氧检测 体外培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞，取对数生长期细胞，以1×105个/孔接种于6孔板内。将细胞分为以下6组：①HMME@PLGA+US组，每孔加入1 ml HMME@PLGA(1 mg/ml)，培养3 h后，以PBS洗涤3次，再以LIFU(超声功率1.5 W/cm2)辐照30 s后立即加入DCFH-DA溶剂，放入培养箱继续孵育30 min，以EDTA-胰酶消化细胞后离心，500 μl PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测产生活性氧水平；②HMME+US组，每孔加入1 ml HMME的重悬液(30.24 μg HMME)，其他步骤同HMME@PLGA+US组；③PLGA+US组，每孔加入1 ml PLGA空白球，其他步骤同HMME@PLGA+US组；④HMME@PLGA组，除不用超声辐照外，其他方法同HMME@PLGA+US组；⑤US组，直接对细胞孔板进行超声辐照，超声能量及其他步骤同HMME@PLGA+US组；⑥对照组，细胞孔板内不加任何试剂，亦不进行超声辐照，直接收集细胞通过流式细胞仪检测活性氧含量。

1.7 体外SDT 取对数生长期人乳腺癌MDA-MB-231细胞，以1×105个/孔接种于激光共聚焦培养皿内。将细胞分为以下4组：①HMME@PLGA+US组，向培养皿内加入1 ml HMME@PLGA(1 mg/ml)，培养数小时后，PBS洗涤3次，超声辐照30 s，功率设定为1.5 W/cm2，然后加入配备好的Calcein-AM/PI染色15 min，EDTA-胰酶消化细胞，PBS洗去多余染料，放置于激光共聚焦仪器上观察治疗效果；②HMME@PLGA组，除不进行超声辐照外，实验方法同HMME@PLGA+US组；③US组，除不加入纳米乳液外，实验方法同HMME@PLGA+US组；④对照组，除了不加入纳米乳液和进行超声辐照外，其余方法同HMME@PLGA+US组。AO染色：除将Calcein-AM/PI染料替换成AO染料外，其余步骤同Calcein-AM/PI染色法。

2 结果

2.1 HMME@PLGA纳米粒的基本特性 制备的多功能纳米粒HMME@PLGA呈浅红色悬着乳液，分散性好；光学显微镜下观察，纳米粒大小均一，形态规则(图1A)；在透射电镜下呈球形，大小约300 nm(图1B)。通过激光共聚焦显微镜观察此纳米粒呈均匀一致的红色颗粒(图1C)。经马尔文粒径仪测得纳米粒的粒径为(333.67±17.50)nm(图1D)，表面电位为(-10.57±1.98)mV(图1E)。该纳米粒在1周内大小、形态无明显变化。

HMME@PLGA纳米粒的包封率为75.62%，载药量为2.90%，浓度为1 mg/ml的纳米粒与人乳腺癌MDA-MB-231细胞共孵育24 h的细胞存活率为87.21%。

2.2 体外光声显像 HMME@PLGA纳米粒在激光照射下显示较强的光声信号(红色)，并且随浓度递增，光声信号逐渐增强；PBS无光声信号，HMME原液(0.48 mg/ml)产生的光声信号较弱(图2)。

图1 HMME@PLGA纳米粒表征 A.光学显微镜下观察； B.透射电镜下观察； C.激光共聚焦显微镜下观察； D.粒径分布图； E.电位分布图

图2 HMME@PLGA纳米粒体外光声显影图 A.PBS溶液； B～F.浓度分别为1、2、4、8、16 mg/ml的HMME@PLGA纳米粒溶液； G.HMME原液(0.48 mg/ml)

图3 流式细胞仪定量测得各组细胞的活性氧含量 A.HMME@PLGA+US组； B.HMME+US组； C.PLGA+US组； D.HMME@PLGA组； E.US组； F.对照组

2.3 体外活性氧检测 HMME@PLGA+US组有大量活性氧产生，与HMME+US组产生的量相当，而其他各组均无明显活性氧产生(图3)。

2.4 体外SDT效果 Calcein-AM/PI染色显示HMME@PLGA+US组细胞大量死亡，呈红色荧光，而其他各组细胞均可见存活，呈绿色荧光(图4A)。AO染色显示HMME@PLGA+US组溶酶体不能显色，而其他各组溶酶体均被染成黄色(图4B)。

3 讨论

恶性肿瘤已成为威胁人类健康的主要原因之一。目前治疗癌症的方式主要有化疗、放疗、手术等，虽能在一定程度上抑制肿瘤生长，但其不良反应不容忽视[5]。SDT较PDT有显著优点，如无创、成本低、操作性强、可有效聚焦深部组织等，但许多声敏剂单线态氧产量低、光毒性作用强、结构不稳定、肿瘤组织选择性低，因而选择高效低毒的声敏剂对SDT的进一步发展至关重要。

HMME具有成分单一、组成稳定、治疗后避光时间短等显著优点[6]，但显著疏水性限制了其临床应用。PLGA具有良好的生物相容性[7-8]和极高的生物安全性，被美国食品药品监督管理局批准应用于药物递送，同时被用于研制纳米材料，在肿瘤显像与治疗方面取得了很大进步与发展[9]。由PLGA包裹HMME纳米粒可提高其稳定性并降低光漂白速率。研究[10-11]表明，HMME不仅具有SDT作用，且在增强光声显像方面亦有显著效果。光声成像是生物医学领域兴起的新型成像技术，主要利用组织光能量的吸收分布推测内部结构，是一种无创、非电离性检测手段，具有组织分辨力好、对比度高、穿透性强等特点[12-13]；然而体内存在许多固有光声信号，如黑色素、血红蛋白等可干扰对肿瘤组织的显影。通过被动靶向作用，纳米级光声造影剂能够选择性聚集在肿瘤病变区域，对于提高诊断准确性、减少体内信号干扰有明显作用。

图4 激光扫描共聚焦图 A～D.分别为 HMME@PLGA+US组、HMME@PLGA组、US组、对照组Calcein-AM/PI染色图； E～H.分别为 HMME@PLGA+US组、HMME@PLGA组、US组、对照组AO染色图

本研究通过双乳化法制备的HMME@PLGA纳米粒，大小均一，且在1周内大小、形态无明显变化，表明其稳定性好。HMME在激光激发下呈红色荧光，激光共聚焦显微镜显示该纳米粒呈均一大小的红色颗粒，表明HMME成功包载于PLGA内。HMME是一种水溶性物质，难以进行生物利用，用PLGA负载后提高了HMME的稳定性，克服了其疏水局限性，有利于其进一步生物利用；该纳米粒与人乳腺癌MDA-MB-231细胞共孵育24 h后87.21%细胞仍能继续存活，提示其具有较高的生物安全性。

HMME@PLGA纳米粒在激光照射下能将光信号转化为声学信号。HMME具有增强光声显影的作用。本研究中，随纳米粒浓度增加，光声信号逐渐增强；而在同等浓度下，HMME@PLGA纳米粒产生的光声信号明显高于HMME原液，提示被包裹的HMME有更好的光稳定性。

DCFH-DA本身无荧光信号，但可自由穿过细胞膜，当其与活性氧接触时，可以产生有绿色荧光的DCF，其荧光信号强度与活性氧水平呈正比。超声波激发下，吞噬了HMME@PLGA的人乳腺癌MDA-MB-231细胞呈现出明显绿色，表明其产生了大量活性氧，对细胞产生明显的杀伤作用，经Calcein-AM/PI染色显示大片细胞坏死(红色荧光)，而单纯超声辐照或者单独纳米球并不能对细胞产生毒性作用，对细胞存活率无明显影响(绿色荧光)，由此证实HMME@PLGA纳米粒在体外具有明显的SDT效果。为进一步验证SDT对细胞器的治疗效果，本研究采用AO染料对细胞进行染色，发现在对照组、US组和HMME@PLGA组中可见细胞周围有大量正常溶酶体，染色后呈黄色，而HMME@PLGA+US组则由于超声辐照后活性氧的产生对细胞产生毒性作用，细胞溶酶体结构破坏消失，无明显染色，进一步证实了活性氧介导的细胞毒性作用。

总之，本研究成功制备了包裹HMME的高分子纳米粒，可显著增强体外光声成像并具有良好的SDT治疗效果，有望成为一种新型的诊疗一体化分子探针。