饲料中转基因大豆成分检测

刘彦泓 刘岑杰

摘 要：

转基因农作物的商品化满足了人民日益增长的物质需求，但转基因作物在食用安全性、对生态环境的影响等方面一直备受关注。本研究采用实时荧光PCR方法检测饲料及饲料原料中转基因大豆GTS40-3-2成分，可以准确、快速完成检测，满足饲料中转基因成分的监管需求。实验表明目前饲料中转基因大豆GTS40-3-2成分的占有率较高，应引起相关部门的重视，加大监管力度。

关键词：

饲料;转基因大豆GTS40-3-2;实时荧光PCR

中图分类号：S-3

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230008

19世纪80年代兴起的DNA重组技术得到了迅猛的发展和广泛的应用。据统计表明：从1996年生物技术即转基因作物商业化第1年以来到2018年底，全球转基因作物的种植面积增长了约113倍，目前已经累计达到25亿hm2。经统计显示2018年有26个国家种植了约1.917亿hm2转基因作物，全世界有70个国家或地区应用了转基因作物。我国是转基因作物种植大国，2018年转基因作物种植面积为290万hm2，居世界第8位[1]。我国除了是转基因作物的种植大国，也是转基因农产品的进口大国。转基因产品除了可能存在潜在的环境污染、生态风险，也可能对人类健康和自然环境带来不利影响[2]。对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康以及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题。因此转基因产品的使用安全性问题一直是人们关心的问题，2002年欧盟要求对转基因产品从生产、运输、保存、销售等过程进行全程的跟踪和检测[3]。目前已有几十个国家和地区对转基因产品采取强制性的标志管理制度。我国2002年3月20日起施行的《农业转基因生物标识管理办法》规定：转基因农产品的直接加工品，标注为“转基因××加工品（制成品）”或者“加工原料为转基因××”。因此开展转基因产品检测，建立完善的检测方法，对满足转基因生物安全监管要求、保证转基因生物标识管理制度方面有重大意义。

目前国内外转基因产品检验方法主要有2种：核酸水平的检测和蛋白水平的检测[4]。核酸检测技术主要包括普通定性PCR检测技术、实时荧光PCR检测技术、数字PCR检测技术、等温扩增检测技术、基因芯片检测技术以及二代测序检测技术等;蛋白检测技术主要包括SDS聚丙烯凝胶电泳分析检测技术、酶联免疫分析检测技术等[5]。另外，还有红外光谱技术鉴别检测方法等其他方法[6]。

本研究采用实时荧光PCR方法，检测饲料中转基因大豆GTS40-3-2成分，针对pCaMV35S、tNOS、GTS40-3-2品系特异基因进行检测，选择市场上市售的不同种类的饲料样品进行检测，表明完全可以满足日常检测需求，为饲料产品中转基因大豆成分检测提供检测技术支持。

1 材料

1.1 原料及试验样品

所有原料和市售饲料样品购自农村小型商店、宠物市场以及超市。原料为4种豆粕;市售饲料样品4种，包括肉牛专用复合预混料、中猪预混料、产蛋鸡饲料、通用型狗粮。转基因大豆GTS40-3-2豆粉标准品为本实验室保存。

1.2 主要试剂

样本DNA提取采用试剂盒：Magnetic DNA Purification System For Food（Promega公司产品）;实时荧光PCR反应试剂：Premix Ex TaqTM （Probe qPCR）（Takara Bio公司产品）。

1.3 引物及探针序列

引物及探针合成、标记均为Takara Bio公司产品，引物及探针序列见表1。

1.4 主要仪器

低温高速离心机（型号：5427R ），Eppendorf（艾本德中国有限公司）产品;实时荧光PCR仪（型号：QuantStudio 7Flex），Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技有限公司）产品。

2 方法

2.1 模板DNA的提取

将样品分别研磨成粉后采用Promega公司Magnetic DNA Purification System For Food试剂盒提取，提取的过程注意防止交叉污染。

2.2 实时荧光PCR检测

反应体系见表2。

扩增条件95℃ 10min;95℃ 1min，60℃ 30s（读取荧光），40个循环。

2.3 实验设置

每个实时荧光PCR反应均需要设置2个平行实验，同时还应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：实时荧光PCR反应体系中使用转基因大豆GTS40-3-2提取的DNA为模板;阴性对照：实时荧光PCR反应体系中采用已知不含转基因大豆GTS40-3-2的大豆DNA为模板;空白对照：实时荧光PCR反应体系中使用无菌双蒸水代替DNA模板。

3 结果及分析

根据扩增结果，内源基因Lectin和外源基因pCaMV35S 、tNOS 、GTS40-3-2检测结果均为阳性，空白对照、阳性对照和阴性对照均符合要求，判定该样品含转基因大豆GTS40-3-2成分。擴增图见图1至图4。（结果为单次实验结果，平行实验结果相同）。

样品1～8分别为：1号豆粕、2号豆粕、3号豆粕、4号豆粕、肉牛专用复合预混料、中猪预混料、产蛋鸡饲料、通用型狗粮）。检验结果表明：仅8号样品未检出转基因大豆GTS40-3-2成分，其余7个样品均含有大豆GTS40-3-2成分。

4 结论与讨论

目前对于转基因大豆成分的检测，最常采用的检测方法就是PCR检测方法，而实时荧光PCR检测的优势有很多：如灵敏度高、操作方便、检测时间短等[4]。目前，实时荧光PCR TaqMan探针技术在植物基因鉴定、水产渔业等方面已经得到了很普遍的应用[8]。对8份市售饲料原料及产品进行检测，检测结果表明：4份豆粕中均检出转基因大豆GTS40-3-2成分，4份饲料中仅通用型狗粮未检出转基因大豆GTS40-3-2成分，其它3种饲料均含有转基因大豆GTS40-3-2成分。本研究表明实时荧光PCR方法完全可以满足饲料中转基因大豆GTS40-3-2成分检测要求，可以用来快速、准确地开展日常检测工作。本研究在实验过程中也发现饲料多经过高温蒸煮、烘烤等生产工艺，因此提取的DNA模板的DNA浓度和纯度不高，模板的浓度和纯度对目的基因的检测来说是较为重要的。建议在實验过程中，利用紫外分光光度计测定模板DNA的浓度，并计算出A260 nm/A280 nm的比值，通常情况下，比值在1.7～2.0之间比较好。同时，在模板DNA质量满意的情况下，建议实时荧光PCR反应体系中模板的添加量为50～100 ng。日常检测数据显示饲料中使用转基因产品的比例很高，而我国对饲料及饲料原料中转基因成分的使用管理力度不大，建议相关部门加强对转基因产品的使用进行监管，保证含有转基因产品的饲料合理、合法使用。

参考文献

[1] 2018年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J].中国生物工程杂志，2019，39（08）：1-6.

[2]王南，李海燕.转基因大豆概况及其安全性[J].吉林农业，2016（19）：118.

[3]方献平，马华升，余红，金亮，刘辉，张乐，翁丽萍，来文国.转基因常见检测技术与蛋白质组学的应用[J].浙江农业科学，2013（10）：1328-1330.

[4]孟静，任易婕，孙潇慧，钟丽霞，霍胜楠.聚合酶链式反应方法检测豆制品中转基因成分的研究概述[J].中国酿造，2018，37（11）：22-25.

[5]石盼盼，王璐，郝丽花，谢文佳，等.大豆及其加工食品转基因成分检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报，2019，10（10）：3166-3172.

[6]方慧，张昭，王海龙，杨向东，何勇，鲍一丹.基于中红外光谱技术鉴别转基因大豆的方法研究[J].光谱学与光谱分析，2017，37（03）：760-765.

[7]国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会. GB/T19495.4-2018 转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法[S].中国标准出版社，2018.

[8]姜文灿，岳素文，江洪，等.TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展[J].临床检验杂志（电子版），2015，4（01）：797-805.

作者简介：

刘彦泓（1976-），女，硕士，高级工程师。研究方向：分子生物学及微生物学检验。