藜芦茎叶的质量标准研究

邢潇 张航 徐彤彤 刘治民 杨建龙 曲艳丽

摘 要：

目的：通过对藜芦茎叶常规检验及特征检验方法的研究，为其质量标准的制定与开发利用提供依据。方法：采用性状鉴定、显微特征及TLC法对其进行定性鉴别;通过水分、总灰分、酸不溶性灰分等常规检查方法对其进行药材质量考察;通过HPLC法测定其活性成分白藜芦醇含量，进一步考察其药材质量。结果：10批样品TLC斑点清晰，分离度好;水分测定值在6.4%～10.6%之间;总灰分测定值在8.5%～13.4%之间;酸不溶性灰分测定值在1.0%～2%之间;白藜芦醇含量在0.007%～0.030%之间。討论：所选性状、显微及TLC方法可有效鉴别药材真伪;所选水分等常规检查方法可在一定程度反映药材质量;所选HPLC方法专属性强，分离度好，方法稳定可靠。

关键词：

藜芦茎叶;质量标准;试验研究

中图分类号：S-3

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230006

藜芦茎叶为百合科植物藜芦（Veratrum nigrum L.）的干燥茎叶，主产于东北、华北、西北、内蒙古等地。藜芦具有吐风痰、定癫痫等作用，用于痰涎涌盛，癫痫喉痹;外用治疗小儿消化不良性腹泻，肠炎等;还有祛痰，催吐，杀虫之效[1，2]。中医用于治疗中风失语及痰壅、黄疸、久拒、喉癖、鼻息、泄痢、头痛、济癣等。现代药理研究表明，藜芦具有抗氧化、降血压作用[3];藜芦中某些成分还具有抗血栓以及增强心肌细胞的收缩功能以改善高血压时的心脏超负荷状态等作用[4]。藜芦化学成分主要为甾体生物碱类化合物、茋类化合物、二肽类、黄酮类及其它类化合物。其中茋类化合物白藜芦醇（C14H12O3）为藜芦中的主要药理活性成分之一。藜芦始载于《神农本草经》，古本草及各省标准中常选用根及根茎作为其药用部位，但考虑其根及根茎中的有毒生物碱成分较多，故部分省市也应用其地上部分作为药用部位[1，5-9]。目前藜芦茎叶尚无国家饮片炮制标准，而其各省标准也较为落后，不能有效地控制藜芦茎叶的药材质量，其质量标准迫切需要提高。

1 仪器与试剂试药

生物显微镜BX51（OLYMPUS）;1260高效液相色谱仪（Agilent）; GR-202电子天平（日本A＼＼D公司）;KQ-500VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;DK-98-11A电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）;101-1A型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）;SX2-4-10型高温箱式电炉（上海博迅实业有限公司）等;中药手工切片刀（深圳众达）。

藜芦茎叶对照药材（长春市食品药品检验中心自制并经专家鉴定，批号：201607）;白藜芦醇对照品（中检院，批号：111535-201703）;色谱甲醇（Fisher Chemical）;乙醇（北京化工厂）等。共选择10批样品为2015年5月—2016年10月之间采集，均为野生样品，并经过吉林中医药大学教授鉴定为百合科植物藜芦的干燥茎叶，见表1。

2 方法与结果

2.1 性状

根据收集到的样品进行性状研究，其性状特征大致如下：本品全长约30～100cm，茎圆柱状，中空，表面灰绿色或棕褐色，茎基部常残留黑褐色网状纤维;叶片椭圆形，基部抱茎，全缘，两面无毛，具数条明显的平行脉;体轻质脆，气微。

2.2 显微特征

植物可以通过具有专属性的显微特征而进行真伪的鉴别。通过显微镜下观察各样品的粉末，发现其有以下显微特征：本品粉末呈黄绿色或棕褐色，淀粉粒较多，呈圆形或椭圆形，直径4～20μm，多为单粒，脐点点状或呈人字状;草酸钙针晶成束或散列于薄壁细胞中，长约40～150μm;导管多为螺纹导管，亦有网纹导管及梯纹导管，直径12～80μm;叶表皮细胞中可见气孔，大小不一。

2.3TLC鉴别

经对不同展开条件进行选择，结果显示，取本品粉末2g，加甲醇30mL，超声处理20min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，作为供试品溶液。另取藜芦对照药材同法制成对照药材，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版 通则0502[10]）试验，吸取上述2种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶5∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。该方法省时、简便、直观，并可以有效对药材真伪进行鉴别。

2.4检查

对药材的常规检查可以有效地评价药材的优劣，主要按《中国药典》2015年版四部通则对药材的检查要求进行水分、总灰分、酸不溶性灰分的检查，其结果见表1。结果显示：10批样品的水分测定值在6.4%～10.6%之间;总灰分测定值在8.5%～13.4%之间;酸不溶性灰分测定值在1.0%～2%之间。

2.5 含量测定

为确保藜芦茎叶药材质量的稳定性、专属性及可控性，采用高效液相色谱法测定藜芦中有效成分—白藜芦醇，按照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0512）进行测定。

2.5.1 色谱条件

试验结果表明： 白藜芦醇经DAD光谱扫描，在306nm处有最大吸收，考虑其基线平稳程度，并根据参考文献中白藜芦醇的检测波长[11]，确定306nm为其测定波长。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，分别以乙腈-水、甲醇-水为流动相，不同流动相比例，不同柱温、不同流速下进行比较，结果显示，乙腈-水（20∶80）可以将白藜芦醇成分有效分析，且分离度不受柱温及流速的影响。

根据实验结果最终确定色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水（20∶80）为流动相;检测波长为306nm。进样量10μL，柱温25℃，流速1.0mL/min。理论板数按白藜芦醇峰计算应不低于1500。

2.5.2 提取方法

取同一批次样品粉末约0.5g，加不同溶剂，采用不同处理方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水（20∶80）为流动相;检测波长为306nm。进样量10μL，柱温25℃，流速1.0mL/min进行样品提取方法学考察，结果显示最佳提取方法为：取本品粉末约0.5g，精密称定，加甲醇50mL，超声处理（功率400W，频率45kHz）40min，过滤，滤液为供试品溶液。10批样品中白藜芦醇的含量测定结果见表1，色谱图见图3。

2.5.3 方法学验证与结果

2.5.3.1 线性及范围

取白藜蘆醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL中含4.864μg（1）及0.0206mg（2）的溶液，摇匀，作为对照品溶液。精密吸（1）1μL，（2）1μL、2μL、5μL、10μL、16μL、18μL，注入液相色谱仪，测定，计算。以对照品峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制白藜芦醇对照品的标准曲线。结果表明，白藜芦醇在2.904～13.794μg范围内，峰面积与白藜芦醇呈良好的线性关系，回归方程为Y = 29944X +22.626，相关系数r = 0.9993。

2.5.3.2 耐用性

分别试验3个不同品牌的C18色谱柱进样，测定。考查不同品牌的色谱柱对待测成分色谱峰的分离效果。

色谱柱a：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）柱

色谱柱b：Agilent C18 （4.6mm×250mm，5μm）柱

色谱柱c：Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm）柱

白藜芦醇平均含量为0.024%、n=3、RSD=3.4%。结果显示;各品牌的色谱柱均能将白藜芦醇色谱峰达到基线分离，样品中各色谱峰峰型及分离度均较好。

2.5.3.3 重复性

取同一批次藜芦茎叶药材，按上文确定的提取方法制备供试品溶液6份，测定白藜芦醇的含量，结果白藜芦醇的平均含量为0.0240%、n=6、RSD=2.9%;说明本方法的重复性良好。

2.5.3.4 仪器精密度

取重现性项下的一份供试品溶液，按上述色谱条件，精密吸取供试品溶液10μL重复进样6次，测定白藜芦醇的峰面积，结果白藜芦醇的平均峰面积为460.001282、n=6、RSD=0.2%。说明仪器精密度良好。

2.5.3.5 准确度

取重现性试验同批次样品（白藜芦醇含量：0.0240%）9份，每份取约0.5g，精密称定，再分别加入3种比例白藜芦醇对照品适量，按标准正文含量测定项下方法制备供试品，进样，测定其中白藜芦醇的含量，计算回收率。结果3种比例白藜芦醇的平均回收率分别为105.07%、n=9、RSD=3.1%。说明本方法回收率良好。

2.5.3.6 稳定性

精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在0h，6h，12h，24h进样，计算峰面积的RSD值。结果白藜芦醇的平均峰面积为741.4033625、n=6、RSD=1.7%。结果表明供试品溶液在24h内稳定。

2.5.4 样品含量测定结果

该方法简单易操作，重复性与分离度均较好。结果显示样品中白藜芦醇含量在0.007%～0.030%之间。考虑原料药产地、加工及生产等因素以及采收时间的影响，发现各地区白藜芦醇含量差异较大。

3 讨论

各省份关于藜芦地上部分的药材标准相对落后，已不能有效地评价藜芦茎叶药材的质量。本研究参照了中国药典2015版药材标准制定技术的相关要求，通过性状特征可有效将其与不同来源及易混淆品种的藜芦如毛穗藜芦、尖被藜芦、狭叶藜芦等进行区别[12，13];显微特征、TLC等项可以进一步有效鉴别药材真伪，TLC方法斑点清晰、分离度好;水分、灰分、总灰分及酸不溶性灰分检查等项可以有效评价药材的质量;通过多条件筛选后的HPLC法可有效测定藜芦茎叶中活性成分白藜芦醇的含量。该方法简单易操作，可重复性及准确度良好，有利于其标准限度的制定及合理用药。

综上，本文的实验结果及方法可以作为藜芦茎叶药材质量标准制定的参考，并为藜芦茎叶药材的质量控制提供理论依据。

参考文献

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作者简介：

邢潇（1983-），女，博士，副主任药师。研究方向：中药材及饮片的质量评价及质量标准研究。